172223. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy diszulfidhídon kívól legalább egy ciszteingyököt tartalmazó peptidek előállítására
21 172223 22 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 I-------------------------------1 21. Boc-Gly-lle-Glu(OBut)-Gln-Cys-Cys(Acm)-Thr-Ile-Cys-Ser(But)-Leu-Tyr(-But)-Gln-Leu-Glu(OBut)(But)-Ser(But) -Asn-Tyr(But)-Cys-Asn-OBut 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 24 15 16 17 18 19| 20 Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-Ser(But)-His-Leu-Val-G!u(OBut)-Ala-Leu-Tyr(But)-Leu-Val-Cys-Cly 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Glu(OBut)-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr(But)-Thr(But)-Pro~ Lys(Boc)-Thr(But)OBut 950 mg Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-Cys-Cys-(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys-Ser(But)-Leu-OH (V) 15 vegyületet és 360 mg, a példa 20. pontjában leírt módon előállított terméket 15 ml DMF-ben oldunk, az oldathoz 70 llI N-etilmorfolint, 136 mg N-hidroxibenzotriazolt és 150 mg diciklohexilkarbodiimidet adunk. Az oldatot ezután 5 óra hosszat 45°-on tartjuk, utána 20 lehűtjük és 100 ml étert adunk hozzá. A csapadékot szűréssel elkülönítjük, éterrel mossuk és szárítjuk. Tisztítás végett a nyersterméket ellenáramú megosztásnak vetjük alá (20: 6 : 11:9 arányú) metanol—0,1 mólos ammóniumacetát (pH =4,75)—kloroform—szén- 25 tetraklorid rendszerben. Az anyag 1425 megosztási lépés után a 42—66 csövekben található. K =0,05. A termék vékonyrétegkromatogramban szilikagélen a következő Rf értékeket mutatja: Rf4, =0,35; R«, = =0,40 és Rfl, 5 *= 0,60. 30 22. Emberi inzulin (h-inzulin) a) E példa 21. pontjában leírt termékből a terc-butiltípusú védőcsoportokat trifluorecetsavval, a merkapto- 35 védőcsoportokat pedig jód segítségével lehasítjuk, miközben egyidejűleg a második diszulfidhidat kialakítjuk az A és a B láncok között : 55 mg, e példa 21. pontjában leírt módon készített terméket szobahőmérsékleten 30 percig 95%-os tri- 40 fluorecetsavval kezelünk. Az oldatot ezután 60 ml 50% - os ecetsavval hígítjuk és azonnal hozzácsepegtetünk 15 ml, jégecettel készített 0,1 mólos jódoldatot. Az oldatot 10 perc elteltével 1,8 ml 1 mólos vizes aszkorbinsav-oldattal színtelenítjük, majd ezt az oldatot 450 ml 45 Sephadex G 25 anyagból álló oszlopon 50%-os ecetsavban sómentesítjük. Az UV-ben 280 nm-nél abszorbeáló eluátumot vákuumban betöményítjük és fagyasztva szárítjuk. Ebből a nyerstermékből a h-inzulint a (10: 10: 0,5 arányú) terc-butanol-1 mólos ammonium- 50 acetát (pH =7,l)-kloroform rendszerben nyerjük ki; K =0,35. A nyerstermék 0,095 mólos nátriumcitrát-pufferból, amelynek a pH-ja 6,0 és 0,03 mól NaCl-t, 0,012 mól ZnCl2-t és 16 térfogat% acetont tartalmaz, tipikus 55 romboéderes kristályok alakjában kikristályosodik. Vékonyrétegkromatogramban cellulózon Rfl01 = =0,55;Rnl2A =0,45. Elektroforézis cellulózacetáton : pH =1,9: futtatási hossz 9 cm az anód felé; pH =8,6: futtatási hossz 7 cm 60 a katód felé [Puffer Brandenburg és mtsai szerint készült: Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 353, 599 (1972)]. b) E példa 21. pontjában leírt termékből először a roerkapto-védőcsoportokat hasítjuk le jód segítségével a második diszulíidhíd egyidejű kialakítása közben, ezt 65 követően pedig a terc-butil-típusú védőcsoportokat távolijuk el trifluorecetsavval. 55 mg, e példa 21. pontja szerint előállított termék 20 ml 87,5%-os ecetsavval készített oldatát 15 ml, jégecettel készített 0,1 mólos jód-oldathoz, amelyet 40 ml 50%-os ecetsavval hígítunk, csepegtetünk és 10 percig szobahőmérsékleten keverünk. A felesleges jódot 1,8 ml 1 mólos vizes aszkorbinsav-oldatban elszíntelenítjük és a reakcióelegyet 450 ml Sephadex G 25 anyagból álló oszlopon 50%-os ecetsavban sómentesítjük. Az UV-ben 280 nm-nél abszorbeáló eluátumot vákuumban betöményítjük és fagyasztva szárítjuk. A maradékot 30 percig 95%-os trifluorecetsavval kezeljük és éterrel kicsapjuk. Ebből a nyerstermékből a h-inzulint a 22. pontban leírt módon kapjuk. 4. példa Cisztinvegyület képzése S-tritil-ciszteinpeptidláncokból egy S-Acm-ciszteinpeptidlánc jelenlétében 2,7 mg (5 }j.mól) acetil-Gly-Cys(Trt)-Gly-OCH3 (I) és 2,7 mg (5 (xmól) Z-Phe-Cys(Acm)-Gly-OCH3 (II) vegyületek 0,8 ml l,l,l,3,3,3-hexafluor-2-propanollal készített oldatához hozzáadunk 0,3 ml, metilénkloriddal készített 0,2 mólos jódoldatot. Az elegyet 10 percig szobahőmérsékleten keverjük és utána 0,4 ml 1 mólos vizes aszkorbinsav-oldattal színtelenítjük. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatogram szerint a reakcióelegy egyedüli cisztinpeptidként az (acetil-Gly-Cys-Gly-OCH3)2 (III) származékot és ezenkívül változatlan Acm-ciszteinpeptidet (II) tartalmaz. Az I, II és III vegyületek Rf-értékei (85: 15, V : V) arányú kloroform—metanol = A rendszer, és (85: 15, V : V) arányú kloroform—trifluoretanol =B rendszer, rendszerekben, 15 cm f uttatási hossz esetén a következők : I II III A 0,53 0,58 0,17 B 0,24 0,26 0,00 A kiindulási anyagokat a következő módon állíthatjuk elő: I. a) Trt-Cys(Trt)-Gly-OMe 3,86 g H-Gly-OMe. HC1 60 ml DMF-fel készített szuszpenziójához 22°-on keverés közben hozzáadunk 4,28 ml trietilamint és ezt követően 20 g Trt-Cys(Trt)-OSu.QHg-t [B. Kamber és munkatársai., Helv. Chim. Acta 53, 556 (1970)], ezután az elegyet 2 óra hosszat keverjük és éjszakán át állni hagyjuk. Ezt követően a 11
