172216. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavulánsav és sói elkülönítésére
19 172216 20 lackban levő ferde tenyészetet 26 °C-on 10 napon át inkubáljuk, majd 100 ml steril vizet adunk hozzá és micélium-szuszpenziót készítünk. Ezzel a szuszpenzióval ezután beoltunk 50 liter, csapvízzel készült és gőzzel sterilizált oltótenyészetet, amelynek összetétele az alábbi: malátakivonat (Oxoid cég terméke) 1 vegyes% bakterológiai pepton (Oxoid cég terméke) 1 vegyes% glicerin 1 vegyes",, 10% Pluronic L81 habzásgátló szójababolajban1 0,05 vegyes% A fenti összetételű táptalajt 90 literes, rozsdamentes acélból készült terelőlapos fermen torba töltjük, amelyben 125 mm-es tárcsáskeverővei 240 fordulat/perc sebességű keverést alkalmazunk. A fermentoron 50 1/perc térfogatsebességgel steril levegőt vezetünk keresztül és a tartályt 26 °C-on inkubáljuk. 72 óra elteltével az így kapott oltótenyészettel 5 térfogat% arányban steril körülmények között beoltunk 150 ml azonos összetételű táptalajt, amelyet előzetesen 300 literes, rozsdamentes acélból készült fermentorba töltöttünk. A fermentorban 210 mm-es tárcsás keverővei 210 fordulat/perc sebességű keverést végzünk, továbbá a fermentoron 150 1/perc térfogatsebességgel steril levegőt vezetünk keresztül. A fermentálást 26 °C-on végezzük. Amikor szükség van rá, 10—10 ml térfogatú adagokban az említett habzásgátlót adjuk a fermentorba. Meghatározott időközökben a fermentléből mintát veszünk az aktivitás meghatározására. A4, és 5. nap között—amikora ß-laktamäzinhibitálási aktivitás optimális — a fermentlét feldolgozásra elvezetjük. A kapott eredményeket az alábbi II. táblázatban ábrázoljuk. II. táblázat Streptomyces clavuligerus 300 literes fermentálásából vett szűrt minták ß-laktamäz inhibitálási aktivitása Fermentációs idő (nap) A klavulánsav koncentrációja mikrogramm/ml-ben Százalékos inhibitálás 1 /2500-szoros végső hígításnál 1,0 6 12 1,5 17 20 2,0 34 31 2,5 54 36 3,0 131 50 3,5 206 54 4,0 150 51 4,5 249 56 5,0 225 55 11. példa Streptomyces clavuligerus tenyésztése Az oltótenyészetet pontosan a 10. példában ismertetett módon állítjuk elő, azonos táptalajt használva. 72 óra elteltével az oltótenyészettel 5 térfogat% arányban beoltjuk a 300 literes, rozsdamentes acélból 1A Pluronic L81 habzásgátló polipropilén-polietilén-tömbpolimert tartalmaz; szállítója a Jacobs and Van den Berg. Ltd. londoni, nagy-britanniai cég, míg a szójababolaj szállítója a British Oil and Cake Mills Ltd. hull-i, nagy-britanniai cég. készült, terelőlapos fermentorba töltött és gőzzel sterilizált táptalajt, amelyet 210 mm-es tárcsás keverővei 210 fordulat/perc sebességgel keverünk. A fermentoron 150 1/perc térfogatsebességgel steril levegőt vezetünk keresztül, a fermentálást 26 °C-on végezve. Szükséges esetben a fermentorba 10—10 ml-es mennyiségben habzásgátlót (10% Pluronic L81 szójababolajban) adunk. Az ebben a lépésben használt táptalaj összetételében a 3. példában használt táptalajhoz hasonlít, azzal a különbséggel, hogy a sterilizálás előtt 0,05 térfogat% mennyiségben 10% Pluronic L81 szójababolajjal készült keverékét adjuk hozzá. A fermentléből vett minták aktivitása hasonló a 10. példában kapott (lásd a II. táblázatot) aktivitásokhoz. A korábbiakban ismertetett, szinergista rendszert alkalmazó papírkromatográfiás vizsgálat tanúsága szerint 0,46 Rf értéknél a klavulánsav zónája észlelhető. A klavulánsav zónájának mérete arányosan nő a ß-laktamäz inhibitálási vizsgálatban mérhető aktivitással. 12. példa Streptomyces clavuligerus tenyésztése Bennett-féle agar-agar táptalajon Roux-palackban 10 napon át 26 °C-on inkubált spórázó tenyészethez 100 ml steril vizet adunk. így micéliumot és spórát tartalmazó szuszpenziót kapunk, amellyel beoltjuk az alábbi összetételű, gőzzel sterilizált és csapvízzel készült, 75 liter térfogatú táptalajt. dextrin 2 vegyes% Arkasoy 50 1 vegyes% 10% Pluronic L81 szójababolajban 0,03 térfogat% A táptalaj végső pH-értékét 7,0-ra állítjuk be. A táptalajt 100 literes, rozsdamentes acélból készült bordázott fermentorba töltjük, amelyben 140 fordulat/perc sebességgel forgó, 190 mm-es tárcsás keverővei keverést végzünk. A fermentoron 75 1/perc térfogatsebességgel steril levegőt vezetünk keresztül 72 órán át 26 °C-on végezve az inkubálást. Az így kapott oltótenyészetet 1500 liter alábbi összetételű, csapvízzel készült és gőzzel sterilizált táptalaj beoltására használjuk : Arkasoy 50 1,5 vegyes% glicerin 1,0 vegyes% kálium-dihidrogén-foszfát 0,1 vegyes% 10% Pluronic L81 szójababolajban 0,2 térfogat% A táptalaj végső pH-ját 7,0-ra állítjuk be. A táptalajt 2000 literes, rozsdamentes acélból készült, terelőlapos fermentorba töltjük, amelyben 106 fordulat/perc sebességgel két 475 mm-es tárcsás keverővei keverést végzünk. A fermentoron 1200 1/perc térfogatsebességgel steril levegőt vezetünk keresztül. Szükséges esetben 25—25 ml-es mennyiségben habzásgátlót (10% Pluronic L81 szójababolajban) adunk a fermentorba. A fermentálást 26 °C-on végezzük mindaddig, míg 3—5 napon belül maximális mennyiségben klavulánsav képződik, éspedig 200—300 [Jig/ml mennyiségben. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
