172216. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavulánsav és sói elkülönítésére
15 172216 16 300 mg p-dimetilamino-benzaldehid 9 ml etanol, 54 ml n-butanol és 9 ml tömény sósavoldat elegyében oldva. Ha az Ehrlich-reagenssel bepermetezett üveglapot 120 °C-on 1—2 percen át hevítjük, a klavulánsav-nátriumsó rózsaszín foltként jelenik meg. A trifenil-tetrazólium-klorid reagens e vegyület 4%-os metanolos oldatából 1 térfogatrész és 1 térfogatrész metanolos nátrium-hidroxid-oldat elegye. A reagenssel végzett bepermetezés után az üveglapot 80 °C-on hevítjük, amikoris a klavulánsav-nátriumsó fehér háttéren vörös foltként jelenik meg. 1. példa Streptomyces clavuligerus tenyésztése 26 °C-on 1 % Yeatex1 márkanevű anyagot (élesztőkivonat), \°/o glükózt és 2% Oxoid agar No. 32 márkanevű anyagot (agar-agar, pH-ja 6,8) tartalmazó agar-agar ferde tenyészeten Streptomyces clavuligerus ATCC— 27064 törzset tenyésztünk. A tenyészetből egy steril oltókacsnyi mennyiséget át viszünk 100 ml folyékony táptalajba, amelyet egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba töltöttünk. A folyékony táptalaj összetétele az alábbi: Oxoid malátakivonat2 10 g/1 Oxoid bakterológiai pepton2 10 g/1 Glicerin 20 g/1 Csapvíz 1 liter A folyékony táptalaj pH-ját nátrium-hidroxid-oldattal 7-re beállítjuk, majd 100 ml-t Erlenmeyer lombikba töltünk, a lombikot műanyaghab-dugóval lezárjuk és 20 percen át 1,05 atm nyomáson autoklávban kezeljük. Ezután végezzük el tulajdonképpen a beoltást, majd a lombikot 3 napon át 26 °C-on 240 fordulat/perc sebességgel forgó és közel 50 mm löketű rázógéppel rázatjuk. Az említett összetételű tápfolyadékot tartalmazó 500 ml-es lombikokat ezután 5% mennyiségben a vegetatív inokulummal beoltjuk, majd a tenyésztést az oltóanyag előállítására alkalmazott paraméterek mellett végezzük. A tenyészetből mintákat veszünk, a mintákat szűrjük és meghatározzuk inhibitáló aktivitásukat Escherichia coli JT4 által termelt ß-laktamäzzal szemben. Az optimális aktivitást 3 napos tenyésztés után érjük el. A kapott eredményeket az alábbi I. táblázatban foglaljuk össze. A szűrt tenyészetet a korábbiakban már ismertetett módon papírkromatográfiásan vizsgálva megállapítható, hogy 0,46 Rf értéknél a klavulánsav zónája észlelhető. A zóna nagysága párhuzamosan nő a (3-laktamázt inhibitáló aktivitással.* A Streptomyces clavuligerus ATCC—27064 törzset 400 ml fenti összetételű tápfolyadékot tartalmazó 2 literes lombikokban is tenyésztjük az előző bekezdésben ismertetett oltóanyagot és tenyésztési paramétereket alkalmazva. Ezekben a nagyobb lombikokban a mikroorganizmus növekedése lassúbb és az optimális p-laktamáz inhibitálási aktivitást a beoltástól számított 7—9 napon belül érjük el. A kapott eredményeket szintén az I. táblázatban foglaljuk össze.** 1 a Bovril Food Ingredients Ltd. (Burton on Trent) nagy-britanniai cég terméke * az Oxoid Ltd. (Basignstoke, Hampshire) nagybritanniai cég terméke * A tenyészetben a klavulánsav koncentrációja az 1., 2.,3.,4., 5.és 6. napon 9,40,225,131, ISO,illetve25! mikrogramm/ml. ** A tenyészetben a klavulánsav koncentrációja a 4., 5., 6., 7., 8. és 9. napon 6, 19, 56, ISO, 190, illetve 131 mikrogramm/ml. 8 I. táblázat 5 10 15 20 Streptomyces clavuligerus 500 ml-es és 2000 ml-es lombikokban végzett tenyésztése útján kapott anyagok fi-laktamázt inhibitáló aktivitása Fermentációs idő (nap) Escherichia coli 1T4 által termelt ß-laktamäz* százalékos inhibitálása a szúrt tenyészet 1/2500-szoros végső hígítása esetében 500 ml-es rázott lombik 2000 ml-es rázott lombik 1 15 _ 2 30 — 3 55 — 4 50 10 5 51 21 6 57 36 7 — 51 8 — 53 9 — 50 1 előállítását lásd az 1. kimutatási módszernél 25 2. példa 30 35 40 45 50 Streptomyces clavuligerus tenyésztése Az 1. példában ismertetett módon kapott vegetatív inokulumot használjuk olyan 500 ml-es Erlenmeyer lombikokban végzett beoltásra, amelyek az alábbi, ionmentes vízzel készült tápfolyadékból 100—100 ml-t tartalmaznak : oldható keményítő1 2 vegyes% glicerin 0,3 vegyes% Scotasol2 0,1 vegyes % Arkasoy3 1 vegyes% vas(II)-szulfát-heptahidrát 0,01 vegyes % A tápfolyadékot 1,05 atm nyomáson 20 percen át autoklávban sterilizáljuk, majd 5% mennyiségben vett vegetatív inokulummal beoltjuk. A lombikokat 26 °C-on az 1. példában ismertetett módon forgó rázógéppel rázatjuk. A klavulánsav optimális titerét 3—5 napon belül érjük el.* A szűrt tenyészet 1/2500-szoros hígítása a ß-laktamáz inhibitálási meghatározásban 60%-os inhibitálást eredményez. A korábbiakban ismertetett papírkromatográfiás kimutatást elvégezve 0,46 Rf értéknél a klavulánsav zónája észlelhető. Ennek a zónának a mérete párhuzamosan nő a ß-laktamäz inhibitálási meghatározásban észlelhető aktivitással. 3. példa Streptomyces clavuligerus tenyésztése Az 1. példában ismertetett módon kapott vegetatív 55 inokulumot használjuk 5% mennyiségben 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba töltött 100—100 ml, ionmentes vízzel készült és a korábbiakban ismertetett módon sterilizált tápfolyadék beoltására, amelynek összetétele az alábbi: zrn 1 Az oldható keményítőt a British Drug Houses LTD., poofo-i (Nagy- Britannia) cég szállítja. *A Scotasol szárított oldható desztillálni maradék (zöldmalátamaradék) szeszlepárlásból; szállítja a Thomas Bort wich LTD. glasgow-i nagy-britanniai cég. * Az Arkasoy szójababliszt; szállítja a British Arkady Co. inanchMfesri, nagy-britanniai cég. * A klavulánsav koncentrációja ekkor 250—350 mikrogramm/ml. W 1A dextrint a CPC LTD. manchesteri, nagy-britanniai cég szállítja.
