172216. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavulánsav és sói elkülönítésére
33 172216 34 Klavulánsav extrahálása ioncserélőgyanta-oldatot alkalmazva A 3. példában ismertetett módon, de 0,01% vas(II)-szulfát-heptahidrát helyett 0,1% kálium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó táptalajt használva kapott fermentléből szűrése után 200 ml-t 5 °C-on 30 percen át Amberlite La2 (szállítja a Rohm and Haas UK Ltd., Croydon, nagy-britanniai cég) oldatával (a gyanta kloridformájú, 15 térfogat%-os metilizobutilketonos oldatából 66 ml-t használunk) extrahálunk. A fázisokat ezután centrifugálás (1660 g, 20 perc) útján elválasztjuk, a 60 ml-es oldószeres fázist pipettával elkülönítjük és négy egyenlő részre osztjuk. 5 °C-on 20 percen át végzett keverés útján mindegyik részt 3,75 ml (egynegyed térfogatrész), az alábbi táblázatban feltüntetett vizes extrahálószerrel extraháljuk. A képződött keverékeket ezután centrifugáljuk (1660 g, 15 perc). Minden egyes extrahálással 3,6 ml térfogatú vizes fázist kapunk. 33. példa Minta Térfogat (ml) Klavulánsav koncentrációja fig/ml Klavulánsav (mg) Szűrt fermentlé 200 128 25,4 Extrahált fermentlé 200 15 3,0 m NaCl extrakt 3,6 305 1.1 2m NaCl extrakt 3,6 598 2,5 m NaNOj extrakt 3,6 638 2,3 2m NaNÖ3 extrakt 3,6 758 2,73 A 2 mólos nátrium-nitrát-oldattal végzett extrahálásnál a szűrt fermentlére vonatkoztatva az extrahálás kihozatala 43%-os. 34. példa Klavulánsav extrahálása ioncserélőgyanta-oldattal A 12. példában ismertetett módon kapott és szűrt fermentléből 47 litert 17 °C-on 1 órán át végzett keverés útján Amberlite LA2 gyanta oldatával (acetátformájú a gyanta; 15,5 térfogat%-os metilizobutilketonos oldatából 12,5 litert használunk) extrahálunk. Miután a keverékhez 500 ml 1-oktanolt adunk, a fázisokat folyamatos átfolyású centrifugában elválasztjuk, amikoris 9,2 liter oldószeres fázist kapunk, amelyet azután 5 °C-on 1,5 órán át 2,3 liter egy mólos nátrium-nitrát-oldattal keverünk. A keveréket ezután folyamatos átfolyású centrifugában fázisaira választjuk szét, amikoris 2,4 liter vizes fázist (amely az átfolyáshoz szükséges vizet is tartalmaz) kapunk. A 8,0 pH-értékű vizes fázis pH-ját ezután tömény sósavoldattal 7,0-ra beállítjuk. Minta Térfogat (ml) Klavulánsav koncentrációja (ig/ml Klavulánsav (mg) szúrt fermentlé 47 146 6862 extrahált fermentlé 47 19 893 m NaNOj extrakt 2,4 1638 3931 Extrahálási hatékonyság tehát 57%. Klavulánsav-kalciumsó 1,6 g klavulánsav-benzilészter metanol és víz 6 ; 1 arányú elegyéből 20 ml-rel készült oldatához 0,8 g, kalcium-karbonát hordozóra felvitt palládiumkatalizátort (5% fémtartalommal) adunk, majd a kapott keveréken szobahőmérsékleten és atmoszferikus nyomáson 25 percen át hidrogéngázt vezetünk keresztül. Ezt követően a katalizátort kiszűrjük, majd a szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot acetonitrillel eldörzsöljük, amikoris krémszínű kristályos csapadék formájában a kalciumsót kapjuk, amelyet kiszűrünk, ezután acetonitrillel, majd dietiléterrel mosunk és levegővel szárítunk. így 0,9 g cím szerinti vegyületet kapunk, amelynek infravörös spektrumában 1782 (í-laktámgyűrű karbonilcsoportja, 1695 (C=C) és 1605 cm ~'-nél (C02_) észlelhető jellegzetes abszorpció. 35. példa 36. példa Klavulánsav-dimetilaminoetanolsó 150 mg klavulánsav 1 ml vízzel készült oldatát átbocsátjuk 10 ml (nedves gyantára vonatkoztatva), dimetilaminoetanolsó formájú IR—120 gyantán (a gyantát a Rohm and Haas philadelphiai, amerikai egyesült államokbeli cég állítja elő), majd vízzel eluálunk. Az 50 ml-nyi eluátumot ezután sziruppá pároljuk, majd a sziruphoz 10 ml acetonitrilt adunk és az így kapott oldatot újra bepároljuk. így halványsárga szirup formájában a cím szerinti vegyületet kapjuk, amelynek infravörös spektrumában 1620 (C02~), 1700(C=C)és 1800 cm-1 nél (ß-laktämgyürü karbonilcsoportja) észlelhető jellegzetes abszorpció. 37. példa Cefem-karbonsavszármazékok, illetve penám-karbonsavszármazékok és klavulánsav közötti baktériumelleni szinergizmus A 32. példában ismertetetthez hasonló, mikrotiteres módszerrel megállapítjuk bizonyos [3-laktamázokkal szemben az alábbi táblázatokban felsorolt hatóanyagok, illetve hatóanyagkombinációk ug/ml-ben kifejezett MIC-értékeit. Megjegyezzük, hogy bizonyos cefem-karbonsavszármazékoknak és penám-karbonsavszármazékoknak önmagában is igen jó az ellenállóképessége meghatározott ß-laktamäzokkal szemben, így az ezekkel a ß-laktamäzokkal szemben mérhető szinergista hatás nem jelentős. Látható azonban a táblázatokból, hogy n indegyik kombináció legalább egy [i-laktamázzal szemben szinergista hatású. A cefem-karbonsavszármazékokkal a Staphylococcus aureus Russell, illetve az Escherichia coli JT 159 és Klebsiella aerogenes Ba95 által termelt ß-laktamäz ellen kapott eredményeket két táblázatban adjuk meg, mert kétféle kísérleti módszerrel kaptuk az eredményeket. Összehasonlítási célokból mindegyik táblázatban megadjuk a cefaloridinnel kapott eredményeket. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 17
