172194. lajstromszámú szabadalom • Eljárás heterológ artéria-transzplantátumok előállítására dinamikus módszerrel
3 172194 4 valamennyi enzimatikus folyamatnál roppant fontos a pH optimális értékének beállítása. Az inkubáció után a proteolitikusan kezelt marha-, illetve borjú-artériákat desztillált vízzel alaposan kimossák, és az enzimatikus reakciókat meghatározott koncentrációjú nátriumklorid-oldattal meghatározott ideig történő kezeléssel állítják meg. A kezelés befejeztével visszamaradt anyag az artériában önmagában jelenlevő kollagén váz. Ez a kollagén cső már nem mutathat antigén hatást, mivel a továbbiakban proteolitikus reagensekkel nem kezelik, így az artériáknak már e lépés végén olyan állapotban kell lenniük, hogy beültetésük ne vonjon maga után antigénantitest reakciót. Az így előkészített artéria azonban még mindig nem alkalmas transzplantálásra, mivel nem rendelkezik a szükséges tömörséggel és stabilitással. ' A megfelelő tömörséget és stabilitást úgy érik el, hogy á kollagén tömlőt meghatározott ideig egy puflérolt cserző-oldatban tartják. Cserzőanyagként eddig a dialdehidkeményítő, glioxál és poliakrolein használata bizonyult előnyösnek, de más cserzőanyagok, például formaldehid, dialdehid-cellulóz, glutáraldehid is használhatók. Az itt végbemenő folyamat angol elnevezése „cross linking”, mely az aminosavaknak a ficines kezelés után jelenlevő szabad aminocsoportjai és a dialdehid-keményítő, illetve más cserzőanyagok aldehid-csoportjai között végbemenő reakció megjelölésére szolgál. A megfelelő magyar szakkifejezés a térhálósítás. A tömörséget úgy ellenőrzik, hogy az eret maximálisan 240 Hgmm nyomású levegővel terhelik, majd az artériákat vízbe merítik. Az így kapott ér-protézist lumenadekvát üvegrúdra viszik fel, majd a megfelelő sterilizáló oldatot tartalmazó lezárható üvegcsőbe helyezik. A sterilizálás ideje 14 nap, és például valamely konzerváló oldatban, 37 °C-on, inkubátorban hajtható végre. A sterilizált ér-protézisek felhasználásukig az üvegcsövekben maradnak. Az eddig ismertetett szokásos munkamenet sztatikus eljárás, azaz a proteolitikus lebontást és a térhálósitást sztatikusan hajtják végre. A transzplantátum ilyen típusu előállítása során azonban nem veszik kifejezetten figyelembe, hogy a kollagén, azaz a fehérjék lebontása után visszamaradt vázanyag is magával hozhat bizonyos immunológiai nehézségeket, különösen ha a szokásos sztatikus eljárás során nem távolítunk el minden akut és szubakut immunogén anyagot, különösen retikulint. Az artériák sztatikus kezelése ezen kívül megnöveli annak veszélyét, hogy az artériák csirákat tartalmaznak, illetve csirákkal fertőzöttek, miáltal kedvezőtlen immunológiai helyzet áll elő. A sztatikus eljárással előkészített artériákon végzett immunológiai vizsgálatok az eddigiekben meglehetősen durva, nem kellőképpen érzékeny eljárásokkal történtek, mint azt A. L. de Weck és U. Jaeger az Internationales Symposium über den Heterologen Gefässersatz, Oktober 1975. St. Gallen, Schweiz konferencián elhangzott előadásában megállapítja. Az ilyen vizsgálatokat végző szerzők közül Mattila, S. P. és Fogarty, T. J. J. Surg. Rés, 15, 81 (1973) cikkében arra az eredményre jutott, hogy az artériák sztatikus eljárással végzett dialdehidkeményítős kezelése az immunologitás jelentős csökkenéséhez vezet ugyan, de teljes megszűnést nem eredményez. A találmányunk kidolgozása során végzett kísérletek bebizonyították azt az eddig csak sejthető tényt, hogy az állati artériákból nyert heterológ transzplantátumok annál jobb és tartósabb eredményeket szolgáltatnak, minél fiatalabb állatok, például borjúk, birkák, malacok artériáit használtuk fel készítésükhöz. Úgy találtuk továbbá, hogy a heterológ artéria transzplantátumok előállítására szolgáló eddigi eljárások előbb ismertetett hátrányai kiküszöbölhetők, ha a proteolitikus lebontást és a térhálósitást folyamatosan hajtjuk végre, azaz hagyjuk, hogy az artériákon átáramoljanak a mindenkori oldatok. A dinamikus eljárás előnyei a következők : A szokásos sztatikus eljárások során a reakcióelegy elszegényedik a reagensekben, különösen az artériák belső részében, ahol a reakcióelegy egyáltalán nem mozog. Ezen felül a sztatikus eljárás végrehajtása során az artériák egymáson fekszenek, ami megakadályozza a koncentráció kiegyenlítődését az artériák belsejében, sőt, az érintkezési helyeket alig éri oldat, így lesznek olyan helyek, ahol a reakció lefolyása akadályba ütközik. Ezzel szemben a reakcióelegy cirkuláltatása a koncentrációkülönbségek kiegyenlítődéséhez vezet, az artériák valamennyi pontja ugyanazzal a homogén oldattal kerül érintkezésbe, és az áramlás következtében a felületet mindig friss oldat éri. A találmány szerinti eljárás végrehajtása során tehát ügyelnünk kell arra, hogy lehetőség szerint fiatal állatok artériáit használjuk fel, és a proteolitikus lebontást és a térhálósitást dinamikusan hajtsuk végre. A dinamikus munkamód a fentiek értelmében elsősorban az artériák belső lumenjeinek állandó kezelését jelenti. A dinamikus eljárás az artériáknak valamilyen csatlakozó elemekkel, például üvegcsövekkel történő összekötésével hajtható végre, ami lehetővé teszi, hogy egyidőben lényegében tetszőleges számú artériát kapcsoljunk össze és ezzel elérjük, hogy a végtermék minősége egységes legyen. A találmány szerinti eljárás értelmében úgy járunk el, hogy a vágóhídon összegyűjtött, jégbe-hűtött, fiziológiás konyhasó-oldatba helyezett borjú artériákat, előnyösen karotidákat a laboratóriumba szállítjuk. Az artériákat ott szabadítjuk meg a környező szövetektől, és kötjük el az elágazó kollaterálisokat selyemmel. Azután következik a proteolitikus lebontás és térhálósítás, melyet az 1. ábra szerinti berendezés segítségével vagy valamely más alkalmas berendezéssel hajthatunk végre. A fentiek szerint előkészített artériákat olivákkal összekapcsoljuk, és először 6,0-os pH-értékre pufferolt, 45—50 °C-os hőmérsékletre termosztált ficin-oldattal mossuk át őket. A ficin-oldat zárt rendszerben cirkulál, de mivel a reagens nagy feleslegben van jelen, a cirkuláltatott fürdőben való kezelés rendelkezik a dinamikus eljárás fent említett valamennyi előnyös vonásával. Miután a proteolitikus lehasítás, azaz az antigén hatású szövet alkotórészek emésztése teljessé vált, az artériákat többször átöblitjük ion-mentesített vízzel, majd híg vizes nátrium-klorid oldattal, végül ismét vízzel. A nátriumklorid-oldatos átöblítés az enzimatikus reakció megállítására szolgál. Ezt követően valamely cserzőanyag, előnyösen dialdehid-keményítő híg vizes, megfelelő pH-értékre pufferolt, előnyösen 8,3 pH-értékű oldatával mossuk át az artériákat, amikor a kollagén rostok szabad amino-csoportjai és a dialdehid-keményítő aldehid-csoportjai közötti térhálósítási reakció játszódik le. Ezután az oldatot kiszívatjuk a rendszerből, és az artériákat az előzőekhez hasonló módon ionmentesített vízzel többször átöblítjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
