172178. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vacina előállítására a Marek-féle betegség ellen
5 172178 6 rendszerint kiöntjük és csak a következő emésztetési frakciókat vesszük fel. Az így nyert sejtszuszpenziót többször mossuk szaporító tápfolyadékkal, majd 7— 8X102 * * * 6 sejt tenyésztő edény mennyiségben szétosztjuk. A sejtszuszpenziót beoltjuk az Országos Közegészségügyi Intézetben 00 130 MNB számon letétbe helyezett Ml tyük-herpesz vírussal. A tenyészeteket 5/ C02-t tartalmazó nedves légterű kamrában 37 °C-on inkubáljuk. A tenyészeteken az indító tápfolyadékot rendszerint a 4. napon cseréljük fenntartó tápfolyadékra. A további 7—10 napos inkubálás során a vírus jól elszaporodik. Ekkor a jellegzetes sejtkárosító hatást mutató tenyészetekről a sejteket 0,1% tripszint és 0,02% EDTA dinátriumsót tartalmazó fiziológiás sóoldat segítségével a tenyésztő edény faláról leválasztjuk és szuszpendáljuk. A sejteket 1000 g gyorsulással 10 percen át centrifugáljuk, majd a felülúszó réteg elöntése után a sejteket indító tápfolyadékban szuszpendáljuk és friss, 4 órás kacsaembrió fibroblaszt (KEF) tenyészetekhez adjuk. A KEF tenyészeteken hét egymást követő passzázst végzünk úgy, amint azt a fentiekben leírtuk. A hét egymást követő passzázsban szaporított anyagot az utolsó átoltás végén 5,5 X 106 sejt/ml dózisokra osztjuk, amelyek 1,026 x 10® plakkformáló egység/ml titerű vírust tartalmaznak. A használt indító tápfolyadék: Earle-f. táptalaj 75% 5%-os laktalbumin hidrolizátum 10% Élesztőkivonat 0,5% Borjúsavó 10% Penicillin 1% Sztreptomicin 1% Kanamicin 1% Fungizon 1% A fenntartó tápfolyadékban a borjúsavó mennyiségét 5%-ra csökkentjük. A sejthez kötött vírust — 196 °C-on folyékony nitrogénben tároljuk. 2. példa Az 1. példa szerinti módon előállított anyag folyékony nitrogénban ( — 196 °C) tárolt ampulláiból 1—1 ampullát felolvasztunk és azok tízszeres hígításból 0,5 ml/Petricsésze dózissal 15—15 darab 48 órás, 10 napos SPF csirkeembrióból készült CSEF tenyészetet oltunk. A Petri-csészéket 5% C02-t tartalmazó nedves légterű keltetőszekrényben 37 °C-on inkubáljuk. A fertőzést követő 48. órában a specifikus sejtelváltozás megjelenését követően a fertőzött edények sejtjeit az 1. példa szerinti oldat segítségével elválasztjuk a tenyésztőedény falától. Az így kapott sejtszuszpenziót 1000 g gyorsulással 10 percen át centrifugáljuk, 10% dimetilszulfoxidot is tartalmazó szaporító tápfolyadékban szuszpendáljuk és 7X1 ml-es mennyiségben szétosztva lassú hűtéssel — 40 °C-ig hűtjük, majd — 196 °C-on tároljuk a következő passzázsig. Ekkor 5—5 ampullát kiemelünk a folyékony nitrogénből és a sejtes anyagot 32—32 db 48 órás SPF CSEF tenyészetre mérjük. 48 óra után a sejteket a fent leírt módon összegyűjtjük, majd 15— 15 ml tároló folyadékban szétosztva 1 ml-es mennyiségben lehűtjük és —196 °C-on tároljuk. A tároló folyadék összetétele: Earle-f. táptalaj 75% Borjúsavó 15% Dimetilszulfoxid 10° „ 3. példa Az avirulens MBHV Ml jelzésű izolátumának patogenitási oltásához az 1. példában leírt módon előállított vírus magas dózisával napos korú, genetikailag ismeretlen fogékonyságú G jelzésű és nagyon fogékony vörös izlandi (Vi) csirkéket oltunk intra-abdominálisan. Az így fertőzött állatokat, valamint nem fertőzött, kontroll társaikat steril levegővel ellátott műanyag izolátorokban tartjuk, csoportonként külön-külön. A megfigyelési időszak alatt mindkét fajta csirke egészséges maradt. A megfertőzött állatokban a vírus elszaporodott, de nem betegítette meg azokat. A kísérlet lefolyását és eredményét az alábbi táblázat tartalmazza. Táblázat db Dózis (PFE/csibe) Visszaizolálás MB pozitív/MB negatív Fertőzött G. 11 7,2 X 104 35. napon 0/9 csoport Vi. 7 1 xio5 0/6 Kontroll G. 8 — 35. napon 0/7 csoport Vi. 6 — 0/5 4. példa A 2. példa anyagának folyékony nitrogénben tárolt sejtjeiből 24 órás SPF CSEF tenyészetet fertőztünk. 0—96 óráig 24 óránként mintát vettünk, amelyet felhasználásig —196 °C-on tároltunk. Az utolsó minta levétele után meghatároztuk az egyes időpontokban a sejthez kötött és ultrahanggal kezelt, sejtmentes vírus titerét. Az ultrahang kezelés során 1,5 amper áramerősséggel 2 ml folyadékban MSE ultrahang készülékkel 10 másodpercig kezeltük a sejtes anyagot. Az így feltárt sejtmentes vírus titere vagy megegyezett a sejtes anyag therével (10® ’9—106’8plakkformáló egység ml) vagy annál alacsonyabb értéket adott (105’9—106’6 plakkformáló egység/ml). 5. példa Laboratóriumi vakcinázási kísérletek Két laboratóriumi vakcinázási kísérletet végeztünk a Marek-féle betegség Ml jelzésű avirulens, sejthez kötött vírus törzsével. Az első kísérletben barna leghom (BrL) SPF állatokat vakcináztunk. Az állatokat túlnyomásos, szűrt levegővel ellátott izolátorokban keltettük. Az 1. számú izolátorban 20 naposcsibét helyeztünk el. A 2. számú izolátorban 10 csibét keltettünk és a kikelést követően 2000 plakkformáló egységet (PFE) tartalmazó sejthez kötött Ml vírust tartalmazó dózissal intraperitoneálisan oltottunk. A fertőzést követő 20. napon az 1. számú izolátorból 10 állatot steril körülmények között áthelyeztünk a 2. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
