172077. lajstromszámú szabadalom • Eljárás félszintetikus 7-amino-cef-3-em-4-karbonsav-származékok előállítására enzimes hidrolizissel és szintézissel

5 172077 6 3. példa 5 g (23,3 mM) 7-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavat és 10 g (50 mM) D-fenil-glicin-metil-észter-hidrokloridot foszfátpufferben (pH = 7,0) szuszpendálunk 25 C°-on és a térfogatot 500 ml-re egészítjük ki. Ezt az oldatot keverés közben 2 liter E. coli ATCC 9637 tenyészetből az 1. példa szerint kapott biomasszával reagáltatjuk. Meghatározott időközönként a képződött cefalexint spektrofotometriásán meghatározzuk [Analyst 92, 247 (1967)]. 1 óra múlva a sejtek lecentrifugálása útján a reakciót megszakítjuk. Az oldat (550 ml) 8 mg/ml 7-(D-fenilglicil)-amino-3-metil-cef-3-em-4--karbonsavat (4,4 g) tartalmaz, ez 54%-os konverziónak felel meg. 4. példa 5 g (23,3 mM) 7-amino-3-metil-cef-3-em-4-kaibonsavat és 10 g (50 mM) D-fenil-glicin-metil-észter-hidrokloridot 3 liter tenyészetből a 2. példában leírtak szerint kapott penicillinázt tartalmazó 500 ml 0,1 M foszfát-pufferben (pH = 7,0) oldunk. 1 óra múlva 25 C°-on az oldat 7,8 g/ml 7-(D-fenilglicil)-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavat tartalmaz (össztérfogat 555 ml), ami 53%-os átalakulásnak felel meg. 5. példa 5 g (23,3 mM) 7-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavat és 10 g (51 mM) D-p-hidroxi-fenil-glicin-etil-észtert 25 C°-on, 0,1 M kálium-foszfát-pufferben (pH = 7,0) oldunk, és az oldatot a fenti pufferrel 1,5 literre töltjük fel. Az oldathoz keverés közben, a pH-t állandó 7,0 értéken tartva, hozzáadjuk az 1. példa szerint előállított, 2 liter E. coli ATCC 9637 tenyészetből származó biomasszát. 1 óra múlva a reakciót megszakítjuk a sejtek centrifugálással való eltávolítása útján. Az oldat 2 mg/ml 7ö-[(4-hidroxi-fenilglicil)-amino]-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavat tartalmaz, ami 35%-os konverziónak felel meg. 6. példa 5 g (23,3 mM) 7-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavat és 10 g (51 mM) D-p-hidroxi-fenilglicin-etil-észtert 25 C°-on 3 liter tenyészetből a 2. példa szerint kapott penicillin-acilázt tartalmazó 1500 ml 0,1 M kálium-foszfát-pufferben (pH = 7,0) oldunk. 1 óra múlva az oldat 1,8 mg/ml 7Ö-(4-hidroxi-fenilglicil)-amido-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavat tartalmaz, ami 32%-os 7-ADCA-átalakulásnak felel meg. 7. példa 5g (18,36 mM) 7-amino-3-acetoximetil-cef-3-em-4-karbonsavat (7-ACA) és 10 g (50 mM) D-fenilglicin-metil-észter-hidrokloridot 25C°-on 1500 ml 0,1 M kálium-foszfát-pufferben (pH = 7,0) oldunk. Az oldatot keverés közben 2 liter E. coB tenyészetből kapott biomasszával reagáltatjuk. 1 óra múlva az oldat 3,0 mg/ml 7-[(D-fenilglicil)-amino]-5 -3-acetoximetil-cef-3-em-4-karbonsavat tartalmaz, ami 60%-os konverziónak felel meg. 8. példa 10 5g (18,36 mM) 7-amino-3-acetoximetil-cef-3-em-4-karbonsavat és 10 g (50 mM) D-fenilglicin-metilészter-hidrokloridot 3 liter tenyészetből kivont penicillin-acilázt tartalmazó 1,5 liter kálium-foszfát-15 -pufferben oldunk. A pH-t folyamatos nátrium-hidroxid-adagolással állandó 7,0 értéken, a hőmérsékletet pedig 25 C°-on tartjuk. 1 óra múlva az oldat 3,1 mg/ml 7-[(D-fenilglicil)-amino]-3-acetoximetil-cef-3-em-4-karbonsavat tartal-20 maz, ami 62%-os átalakulásnak felel meg. 9. példa 25 5g (18,36 mM) 7-amino-3-acetoxirnetil-cef-3-em-4-karbonsavat és 9,75 g (50 mM) p-hidroxi-fenilglicin-etil-észtert 25C°-on 1,5 liter 0,1 M kálium-foszfát-pufferben (pH = 7,0) oldunk. Az oldatot keverés közben 2 liter E. coli ATCC 9637 30 tenyészetből kapott biomasszával reagáltatjuk. 1 óra múlva az oldat 1,7 mg/ml 7Ö-[(4-hidroxi-fenilglicil)- amino ]-3-acetoximetil-cef-3-em-4-karbonsavat tartalmaz, ami 33%-os átalakulásnak felel meg. 10. példa A 9. példa eljárását követjük, azzal a különbséggel, hogy a biomasszát 3 liter E. coli ATCC 9637 40 tenyészetből származó enzim-kivonattal helyettesítjük. A reakció végén 30%-os átalakulást kapunk. Szabadalmi igénypontok: 45 1. Eljárás I általános képletű 7-amino-cef-3-em-4--karbonsav-származékok előállítására, mely képletben 50 R jelentése hidrogénatom vagy III általános képletű csoport, ahol X' hidrogénatomot vagy hidroxilcsoportot, és X" hidrogénatomot vagy aminocsoportot jelent, és Rí jelentése hidrogénatom vagy acetilcsoport, 55 azzal jellemezve, hogy a) valamely, a G-penícillin gyűrűjének kémiai kibővítéséből származó I általános képletű 7-acilamino-cef-3-em-4-karbonsav-származékot, melyben 60 R jelentése olyan III általános képletű csoport, amelyben X' és X" hidrogénatomot jelent, és R! a fentiekben megadott, foszfátpufferben Escherichia coli ATCC 9637 baktériumsejtekkel, vagy abból kivont és tisztított penicillinacilázzal kezelünk, a 65 keletkezett I általános képletű 7-amino-cef-3-em-4-3