172074. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimes reakciók végrehajtására kétfázisú vizes-szerves rendszerek alkalmazására
5 172074 6 Vizsgálati adatok Szerves oldószer Optikai sűrűség 340 nm-nél Optikai sűrűség 340 nm-nél 2 óra után 22 óra után etilacetát butilacetát etiléter butanol 1,4 1,3 1,2 0,55 3,4 3,2 2,5 1,9 O.D. = optikai sűrűség Ha egyáltalán nincs jelen szerves oldószer, az optikai sűrűség teljes emelkedését 340 nm-nél a tesztoszteronnak vízben való szolubilizálhatósága korlátozza (a telített oldat 25-30 /Líg/ml tesztoszteront tartalmaz). így, ha nincs jelen szerves oldószer, az optikai sűrűség nem haladja meg körülbelül a 0,3 értéket. 10 15 egyesítünk az LDH és HSDH szabad enzimekkel. A vizes oldatot egyenlő térfogatú szerves fázissal elegyítjük, amely tartalmazza a tesztoszteront és a reakciót a két fázis emulgeálásával indítjuk. A reakció előrehaladását rázassál segítjük elő, a tartóedényt egy rázógépben elhelyezve percenként 90 rezgéssel rázzuk. A különböző reakciók előrehaladását az átalakult és át nem alakult szteroidmennyiségek meghatározásával határozzuk meg, amelyek a szerves fázisban vannak jelen. Egy adott időpillanatban a fázisokat összekeverjük, kiveszünk egy meghatározott térfogatú részt a szerves fázisból, majd vékonyréteg kromatográfiával meghatározzuk a tesztoszteront és az androsztén diont, eluensként etilacetát-benzol-n-hexán rendszert használva (összetétele: 100 : 80 : 60). A szteroidokat a hordozóból CHCl3 -mal extra-20 háljuk (24 óra szobahőmérsékleten) és miután a CHCl3 -ot elpárologtattuk, spektrofotométerrel analizáljuk a mintát 240 nm-nél, etilalkoholban. 3. példa Hidroxiszteroid-dehidrogenáz + tejsav dehidrogenáz Enzimforrás Pseudomonas testosteroni sejtekből származó hidroxiszteroid-dehidrogenáz (HSDH), tejsav dehidrogenáz (LDH) (Bahringer Mannheim AG gyártmány, katalógusszám 15371 Elac). Reakciók: HSDH 1. Tesztoszteron + NADT __ androszteron-3, 17-dion + NADH + H* 2. Piruvát + NADH + H* NADH LDH 25 Kísérleti rész Az átalakulási vizsgálatokat olyan koncentráció-körülmények között végeztük, amelyek az LDH gátlására vonatkozó határkoncentrációkhoz vannak 30 közel (0,2 mól piruvát). A cél annak bizonyítása volt, hogy kis térfogatoknál és kis NAD mennyiségeknél nagymennyiségű átalakult szteroidot kaphatunk, teljes átalakulás és nagytisztaságú termék jön létre. 35 A A4 -A 5 izomerázt tartalmazó nyers HSDH felhasználásával ezeket a vizsgálatokat különböző pH-értékeknél végeztük. 40 laktat + NAD+ (And,)(NADH)qr) j2( ,, ioJ (Teszt) (NAD) (Lakt) (NAD+ ) K2 = ^ !± ' =0 ,4-10 12 (Par) (NAD) (H*) Az 1. és 2. reakciók egyensúlyi állandója: (Andr) (Lakt) K = Kt • K 2 0=- — = 1,07 • 10 4 (Teszt) (Pir) Egyensúlyi körülmények között a reakció független a (H+ ) és NAD + vagy NADH koncentrációktól. Vizsgálati módszer Egy típusvizsgálatban 3 ml pufferoldatot, amely az oxidált ko-faktort és a Na-piruvátot tartalmazza, 50 55 60 Vizes fázis 1,5 ml 0,4 mólos foszfátpuffer 15 Na piruvát (1 ml H2 0) 45 1500 7 NAD (0,5 ml H20) 1,5 mg LDH =1,6 egység HSDH =0,16 egység Szerves fázis 3 ml butilacetát 30 mg tesztoszteron Az a feltételezés, hogy azok a szteroid foltok, amelyeket a vékonyrétegkromatográfiás lemezeken találtunk a A4 -androsztén dionénál nagyobb Rf értékkel, a A5 -androsztén-dion foltjai. A táblázat adataiból látható, hogy 72 órás reakcióidő után 7,8 és 8,8 pH értékek között teljes átalakulás következik be, de a reakciótermék csak 8,8 pH értéknél lesz kromatográfiai szempontból 65 tiszta. 3
