171986. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sztreptokokkusz-anyagcseretermékek, különösen sztreptokináz, sztreptodornáz, sztreptolinizin 0 és hialuronátliáz kinyerésére
3 171986 4 lét egy órán át szobahőmérsékleten vagy a fermentálás hőmérsékletén keverjük, akkor az összes Streptococcüst elöljük. Az elölt baktériumsejteken adszorbeálódott fehérjéket (a sztreptolizin O-t, hialuronidázt, sztreptodomázt és a sztreptokinázt) a baktériumsejtekkel együtt centrifugálás útján elkülönítjük Az egyes fehérjéket ezután pH 8,0 értéken 0,1 mólos foszfát pufferrel végzett eluálás útján az elölt baktériumsejtektől elkülönítjük. Az anyagcseretermékeknek a találmány értelmében így végzett koncentrálásához meglepő módon semmiféle adalékanyagra nincs szükség, természetesen ha az alkalmazott savtól eltekintünk. A tenyésztésre, amely nem képezi a találmány tárgyát, nem kívánunk részletesen kitérni. A fentiekben említett sztreptokokkusz-anyagcseretermékeket tartalmazó fermentlé előállításához célszerűen a Streptococcus equisimilis IMET B 377 törzset (deponálva zentrali Institut für Mikrobiologie und experimentalle Therapie. Jena, NDK, törzsgyűjteményben) és a 170 102 sz. magyar szabadalmi leírásban ismertetett eljárást alkalmazzuk. Felhasználhatjuk azonban a találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként a 923 453 és 924 562 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírásokban ismertetett eljárásokkal kapott fermentleveket, különösen az utóbb említett szabadalmi leírásban ismertetett ß-hemolizalo hatású Streptococcusok közül az úgynevezett Lancefield A, valamint Human C és G csoportba tartozó mikroorganizmusok tenyésztése útján kapott fermentleveket is. A találmány szerinti eljárás abban áll, hogy a fermentált tenyészet pH-értékét 3,5-re beállítjuk, majd 10 C° és 37 C° előnyösen 10 C° és 20 C° közötti hőmérsékleten végzett keverés útján az anyagcseretermékeket az elölt sejteken adszorbeáltatok, ezután a centrifugálás útján elkülönített sejtmasszát 8 pH-értéken 0,1 mólos foszfátpufferrel eluáljuk, és ezt követően a) sztreptolizin O, sztreptodornáz, sztreptokináz és hialuronátliáz kinyerése céljából az eluátumban ammónium-szulfát-oldattal kicsapást végzünk, a csapadékot 0,02 mólos foszfátpufferben újraoldjuk és az oldatot térhálósított dietilaminoetil-agarózból készült kromatográfiás oszlopra felvisszük, majd 8,0 pH-jú 0,02 mólos foszfátpufferrel és 7,6 pH-jú, foszfátra nézve 0,02 mólos és nátrium-kloridra nézve 0,4 mólos pufferrel gradiens eluálást végzünk, vagy b) hialuronátiiáz kinyerése céljából az eluátumot közel azonos térfogatú 0,1 mólos foszfátpufferrel hígítjuk, a kapott elegyhez 6 és 7 közötti pH-értéken nagy diszperzitásfokú szilícium-dioxidot keverünk és a szilícium-dioxidtól elválasztott oldatból a hialuronátliázt ammónium-szulfáttal kicsapjuk, centrifugálással elkülönítjük, vízben újraoldjuk, 0,02 mólos foszfátpufferrel szemben dializáljuk és a dializátumot az a) változatban ismertetett módon kromatografáljuk, illetve sztreptokináz és sztreptodornáz kinyerése céljából az ezeket adszorbeálva tartalmazó szilícium-dioxidot 9,5 és 10,5 közötti, előnyösen 10,0 pH-értéken vízzel eluáljuk, majd az eluátumot egymás után 10%-os nátrium-klorid-oldattal, kalcium-foszfáttal és ammónium-szulfáttal kicsapásnak, végül pedig az a) változatban ismertetett kromatografálásnak vetjük alá, vagy c) sztreptokináz és sztreptodornáz kinyerésére az eluátumot egymás után 10%-os nátrium-klorid-5 -oldattal és kalciumfoszfáttal kicsapásnak, ezután frakcionált ammónium-szulfát-kicsapásnak és végül az a) változatban ismertetett kromatografálásnak vetjük alá. Az a) változatban említett oszlopot úgy regene-10 ráljuk, hogy a például 2,5 cm x 25 cm méretű oszlopot 1 liter 0,5 n nátrium-hidroxid-oldattal, steril vízzel és steril 0,02 mólos foszfátpufferrel (pH-ja 8,0) mossuk. Kloroform adagolása (4 ml 1 liter pufferhez) konzerválószerként jó eredményekhez 15 vezet. A találmány szerinti eljárás előnye abban áll, hogy az anyagcseretermékek elkülönítéséhez nincs szükség nagyobb mennyiségben adalékanyagok alkalmazására és minthogy a Streptococcusokat az 20 eljárás első lépéseként elöljük, nincs fertőzési veszély. Továbbá az említett egyszerű módon egyidejűleg az összes fontos anyagcseretermék elkülöníthető és azonos módon ugyanazon speciális ioncserélőn tisztítható. 25 A találmányt az alábbi kiviteli példákkal kívánjuk közelebbről megvilágítani. A kiviteli példákban az egyes anyagcseretermékekre megadott aktivitásértékeket az alábbi irodalmi helyek szerint határoztuk meg: 30 sztreptodornáz: Anal. Biochem., 11, 327-334 (1965), sztreptolizin O: Biochem. I., 35, 1124-1139 (1941), hialuronátliáz: Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Org. A., 35 221, 296-302 (1972) és sztreptokináz: Bull. Wld. Hlth. Org., 33, 235-242 (1965). 40 1. példa Koncentrált sósavval pH-ját 3,5-re beállítjuk és 1 órán át keverünk 5 liter olyan fermentlét, amelyet Streptococcus equisimilis IMET B 377 (vagyis C 45 csoportba tartozó Streptococcus) 30 órán át tartó tenyésztése útján kaptunk és amely 7,2 pH-értéken 28C°-on 128HU/ml sztreptolizin C-t, 100TE/ml hialuronátliázt, 4200 Christensen-egység/ml sztreptokinázt és 500 viszkozimetrikus egység/ml sztrep-50 todornázt tartalmaz. A fermentlét ezután centrifugáljuk és a felülúszó fázist elöntjük. így 1 liter fermentíéből átlagosan 10 g nedves sejtmasszát kapunk. Az elöntött felülúszó fázis 50 egység/ml (közel 1-2%) sztreptokinázt, 20 egység/ml-nél keve-55 S ebb (közel 20%) sztreptodomázt, 1 TE/ml-nél kevesebb (1%) hialuronátliázt és 20 HU/ml-nél kevesebb (közel 10%) sztreptolizint tartalmaz. A sejtmasszát ezután 250—250 ml 0,1 mólos foszfátpufferrel (ph-ja 8,0) kétszer mossuk. Ekkor gyakor-60 latilag kvantitatív mértékben az összes anyagcseretermék eluálódik. Az egyesített eluátumot ezután tisztára centrifugáljuk, majd a benne levő anyagokat 100 ml oldatra számítva 60 g ammónium-szulfáttal kicsapjuk. A csapadékot ezután 50 ml 65 0,02 mólos foszfátpufferben (pH-ja 8,0) feloldjuk, 3
