171838. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(alfa-fenil-alfa-amino)- acetamido-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav észterek előállítására

7 171838 8 lyen ioncserélő gyantával, vagy hasznosítva azt, hogy a 2-fenil-glicin izoelektromos pontjánál a 2-fenil-glicin és az I általános képletű termék oldékonysága eltérő. Az I általános képletű vegyület elkülöníthető továbbá a reakcióelegyből enyhe reakciókörülmények között ismert módszerekkel, így például kromatográfiás úton, vagy valamely olyan szerves sav vagy bázis felhasználásával, amely az I általános képletű termékkel vízben nem oldódó sót képez. Az I általános képletű 7-(a-fenü-a-amino)-acetamido-3-metil-cefem-4-karbonsav-észterek például valamilyen alkalikus oldattal végzett kezelés útján a korábbiakban már említett la általános képletű 7-(a-fenil-a-amino)-acetamido-3-metil-cefem-4-karbonsavakká alakíthatók. A találmányt közelebbről az alábbi referenciapéldákkal és példákkal kívánjuk megvilágítani. A példákban megadott százalékértékek vegyes%-ban értendők. A referenciapéldákban és a példákban használt három különböző táptalaj összetételét az alábbiakban adjuk meg. A jelzésű táptalaj: Komponens Nátrium-glutamát Élesztőkivonat Pepton Kálium-hidrogén-foszfát Magnézium-klorid Vas(II)-szulfát Szacharóz pH-érték B jelzésű táptalaj pH (g/deciliter) 25 0,2 0,2 0,5 0,2 0.1 0,01 2,0 7,2 Burgonya-infúzió 10 Élesztőkivonat 1,0 Tioglikolsavat tartalmazó közeg (gyártó cége: Daigo Nutritive Chemicals, Ltd., Japán) 1,0 Glicerin 1,5 Glükóz 0,3 pH 7 Komponens % (g/deciliter) fát-pufferoldattal (pH értéke 6) mossuk és ugyanennek a pufferoldatnak 20 ml-jében szuszpendáljuk. A szuszpenziót ezután kémcsövekbe töltjük, egy-egy kémcsőbe 2 ml-t. D-2-fenil-glicin-metilésztert és az alábbiakban 5 felsorolt 7-amino-3-dezacetoxi-cefalosporánsav-észtereket (a 7-amino-3-dezacetoxi-cefalosporánsavat a továbbiakban „7—ADCA" rövidítéssel jelöljük) szuszpendálunk vagy feloldunk 3—3 ml 0,1 N vizes kálium-hidrogén-foszfát-oldatban (pH-ját előzetesen 6,0-ra beállít-10 juk) olyan mennyiségben, hogy a kapott szuszpenziók vagy oldatok 60 millimólosak illetve a 7—ADCA-észterre vonatkoztatva 30 millimólosak legyenek, és ezt követően a szuszpenziókat vagy oldatokat egy-egy kémcsőbe töltjük, amelyekbe — mint említettük — a sejt-15 szuszpenziót már előzetesen betöltöttük. Ezután a kémcsöveket 37 °C-on tartjuk, majd a reakcióelegyből 0, 1, 2 és 4 óra után 0,5—0,5 ml-es mintát veszünk. Miután a mintákhoz 2,0 ml tetrahidrofuránt adtunk, minden egyes mintát centrifugálunk a sejtek és a denaturálódott 20 fehérje elkülönítésére, majd a felülúszó fázisban megmérjük a reagálatlan 7—ADCA-észter mennyiséget, a képződött 7-(«-helyettesített-«-amino)-acetamido-3-helyettesített-cefem-4-karbonsav-észter mennyiségét, valamint a cefem-mag százalékos kihozatalát. Ezeket a mérési adatokat összehasonlítjuk a 0 órás mintánál mért adatokkal, hogy megállapítsuk a reakció okozta változásokat. A reagálatlan 7—ADCA-észter mennyiségét úgy ha-30 tározzuk meg, hogy a felülúszó fázisból 0,5 ml-es mintát veszünk, a mintából az oldószert ledesztilláljuk, majd a desztillációs maradékot 5 ml térfogatra 5%-os vizes hangyasav-oldattal felhígítjuk, és az így kapott elegyben az észtertartalmat Marelli, L. P. módszerével [J. Pharm.Sci., 35 57,2172 (1968)] mérjük. A képződött temek mennyiségét szilikagélen végzett vékonyréteg-kromatográfia útján (futtatószerek: a) n-butanol, ecetsav és víz 4: 1:5 arányú elegyének felső fázisa; b) kloroform és aceton 8: 2 arányú elegye; c) metilén-klorid és éter 1: 1 arányú 40 elegye] ibolyántúli fényt abszorbeáló, ninhidrinre pozitív foltként mérjük. A cefem-mag összes százalékos kihozatalát a felülúszó fázis 260 mpi-nál mérhető fényabszorpciója alapján számítjuk ki. Minden egyes minta esetében a cefem-mag kihozatalát 100%-osnak találtuk. 45 A kísérletek során használt 7—ADCA-észtereket és a kapott eredményeket az alábbi I. táblázatban adjuk meg. Kontrollként 7-ADCA-t is reagáltatunk azonos körülmények között. C jelzésű táptalaj Húskivonat Pepton Nátrium-klorid 1. referenciapélda 1,0 1,0 0,5 pH 7 50 55 60 Xanthomonas oryzae (IFO—3955) egy napos, ferde tenyészetével egy 1 literes lombikba töltött 100 ml A jelzésű táptalajt beoltunk, majd rázás közben 28 °C-on 20 órán át tenyésztünk. Ezt követően a sejteket centrifugálás útján elkülönítjük, majd 100 ml 0,05 mólos fősz- 65 Xanthomonas citri (IFO—3835) 1 napos, ferde tenyészetét alkalmazva a fentiekben ismertetett vizsgálatokat megismételjük. A kapott eredményeket szintén az alábbi I. táblázatban adjuk meg. A referenciapéldák és a példák ismertetése során a képződött termék mennyiségét az alábbi jelölésekkel adjuk meg (a termék koncentrációját durván, denzitométerrel határoztuk meg): —: nem mérhető ± : kisebb, mint 0,01 (a kiindulási 7—ADCA-észterhez viszonyított mólarány) + : 0,01—0,05 + + : 0,05—0,3 + + + : több, mint 0,3 4