171784. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pirazol-származékok előállítására

171784 3 4 b) Színreakció: (i) A vizsgálandó minta kezelése: 2 ml, a fenti lépésben kapott folyadékfázishoz 1 ml 3,5-dinitro-ftálsav-oldatot (1,5 g monopiridinium-3,5--dinitro-ftalát/500 ml víz) és 1 ml nátriumkarbonát — nátriumhiposzulfit oldatot (125 g, illetve 25 g/500 ml) adunk. A kapott oldatot 10 percig 100 C°-on tartjuk, majd folyó vízzel 3 percig hűtjük, és vízzel 20 ml végtérfogatra hígítjuk. (ii) A vakpróba kezelése: A fenti ismertetett módon járunk el, azonban 2 ml folyadékfázis helyett 2 ml vizet használunk fel. c) Kolorimetriás meghatározás: A vakpróba 450 nm hullámhosszon észlelt elnyelését 0-nak tekintjük. A vakpróba és a vizsgálandó minta elnyelésének különbségéből következtetünk a vér glükóztartalmára. A kontrollokhoz viszonyított %-os vércukorszintcsökkenést az 1. táblázatban közöljük. * a kontrolitól szignifikánsan különbözik (p < 0,05) ** a kontrolitól szignifikánsan különbözik (p <0,01) 2. A 4. sz. vegyülethatástartamának vizsgálata A találmány szerinti eljárással előállított új vegyületek hatásának részletesebb elemzése céljából a vegyületek egy jellegzetes képviselőjének, a 4. példa szerint előállított vegyületnek (a továbbiakban: 4. sz. vegyület) felhasználásával további farmakológiai vizsgálatokat végeztünk. A 4. sz. vegyület hatástartamát a korábban ismertetett szűrővizsgálat körülményei között vizsgáltuk. A kikötött és glükózzal kezelt patkányoknak 1%-os karboximetilcellulóz-oldattal készített szuszpenzió formájában, orális úton 50 mg/kg 4. sz. vegyületet adtunk be, és a hatóanyag beadását követő 2, 4 és 6 óra elteltével Momose módszerével meghatároztuk az állatok vércukor-szintjét. Az eredményeket a 2. táblázatban közöljük. A táblázat adataiból megállapítható, hogy a 4. sz. vegyület hatásideje hosszabb az összehasonlító anyagként felhasznált Tolbutamid hatásidejénél. 3. A 4. sz. vegyület dózisa és vércukorszint-csökkentő hatása közötti összefüggés vizsgálata Kikötött, glükózzal előkezelt patkányoknak a 3. táblázatban közölt dózisban orális úton 4. sz. vegyületet, illetve Tolbutamidot adtunk be, majd meghatároztuk az állatok vércukor-szintjét. Az eredményeket a 3. táblázatban közöljük. A 3. táblázat adataiból megállapítható hogy a 4. sz. vegyület még 1,14 mg/kg-os dózisban is igen jó vércukorszint-csökkentő hatást fejt ki, míg a Tolbutamid kis dózisban hatástalan. 4. A 4. sz. vegyület alloxánnal diabetesessé tett patkányokon kifejtett vércukorszint-csökkentő hatásának vizsgálata 5. A 4. sz. vegyület adrenalektomizált patkányokon kifejtett vércukorszint-csökkentő hatásának vizsgálata A kísérleti állatok mindkét mellékveséjét eltávolítottuk, majd a patkányoknak 6—7 napon át ivóvízként 1%-os vizes nátriumklorid-oldatot adtunk. Ezután a patkányokat 16—18 órára kikötöttük, majd a patkányok hátába vizes oldat formájában 150 g testsúlyra vonatkoztatva 100 mg glükózt fecskendeztünk. Közvetlenül a glükóz befecskendezése után 1%-os karboximetilcellulóz-oldattal készített szuszpenzió formájában, orális úton beadtuk a vizsgálandó vegyületet. A hatóanyag beadását követő 2 óra elteltével a patkányokat nátrium-pentobarbitállal altattuk, és a patkányok vena cava candalisából vérmintát vettünk. A vércukor-szintet Momose módszerével határoztuk meg. Az eredményeket az 5. táblázatban közöljük. A táblázat adataiból megállapítható, hogy a 4. sz. vegyület még 0,125 mg/kg-os 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1. táblázat Vércukorszintcsökkenés, % Vegyület (példa száma) 2 óra 5 óra elteltével elteltével í. 22,1* 19,8 2. 37 J** 26,0* 3. 41,7 25,7 4. 41 9** 25,2** 5. 35,2** 34,1** 6. 33,3** 22,1** 7. 41,6** 23,3** 8. 42,5** 22,1** 9. 48,1** 27 7** 10. 42,1 3,3 11. 37,9 1,4 12. 32,6 4,0 13. 51,3 5,0 14. 43,6 -0,9 Tolbutamid (összehasonlító) 54,1** 52,4** Hím patkányok farki vénájába frissen készített, 2,5/,os oldat formájában 50 mg/kg alloxánt fecskendezünk, 25 majd az alloxan beadását követő 7. naptól kezdve az állatoknak injekció formájában napi 1—4 egység inzulint adunk be. A kísérlethez azokat az állatokat használjuk fel, amelyek az alloxános kezeléstől számított 2 hónap elteltével életben maradtak. 30 Az alloxánnal diabetesessé tett patkányokat az utolsó inzulin-dózis beadása után 24 órára kikötöttük, majd az állatoknak orálisan beadtuk a vizsgálandó vegyületet. Az állatok vércukor-szintjét Momose módszerével határoztuk meg a hatóanyag beadása előtt, illetve 2, 4 és 35 6 órával a hatóanyag beadása után. Tekintettel arra, hogy az alloxan elroncsolja a Langerhans-szigetek pankreatikus (3-sejtjeit, és így a Tolbutamid ebben az esetben nem fejthet ki vércukorszint-csökkentő hatást, a kísérletben összehasonlító anyagként Phenfor-40 mint (fenetil-biguanidint) alkalmaztunk. Az eredményeket a 4. táblázatban ismertetjük. A táblázat adataiból megállapítható, hogy a 4. sz. vegyület igen jó vércukorszint-csökkentő hatást fejt ki, és — a Phenforminnal ellentétben — aktivitását 6 óra elteltével is megtartja. 2