171718. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új antibiotikum előállítáásra
17 171718 oldatot a fenti összetételű ferde agáron nőtt Actinoplanes CBS 434.74 mikroorganizmus micéliumával beoltunk. A lombikokat 28 °C-on körrázógépen 8 napon át inkubáljuk, utána mintákat veszünk és centrifugáljuk. Megvizsgáljuk a tiszta, felülúszó oldatnak az agarlemezlyuktesztben Escherichia coli ATCC 9637 elleni hatását. A tenyészoldatban levő antibiotikum mintegy 17 mm átmérőjű gátolt növekedésű zónákat eredményez. Az antibiotikum elkülönítését a 3. példában írjuk le. 2. példa Tápoldat összetétele: dextrin 0,4% glicerin 0,2% élesztőkivonat 0,2% CaC03 0,2% csapvíz ad 100,0% Habmentesítés céljából hidroxilcsoportokat tartalmazó semleges poliolt (Niax Polyol LHT 67; gyártja: Union Carbide Bel. N. V.) adunk a tápoldathoz 3,0 ml/8 liter mennyiségben. Levegőztető berendezéssel és keverővel ellátott üvegfermentorokba 8—8 litert töltünk a fenti tápoldatból, a pH értéket nátriumhidroxid-oldattal 6,8-ra állítjuk be, és az oldatot 120 °C-on sterilizáljuk. A lehűlt oldatot a CBS 434.74 törzs 3 napon át „A" tápoldatban tenyésztett kultúrájának 240 ml-ével (3,0 tf.%) beoltjuk és mintegy 4 liter levegőt vezetünk át percenként, a keverő fordulatszámát kb. 600-ra állítjuk be, és a hőmérsékletet 28 °C-on tartjuk. A tenyésztés kezdete után 17, illetve 24 órával 0,4% dextrint, 0,2% glicerint és 0,3% élesztőkivonatot adagolunk a fermentorokba. 30, 41, 48 és 54 óra elteltével 0,4% dextrint, 0,2% glicerint és 0,4% élesztőkivonatot adagolunk. A fenti adalékokat tömény oldat alakjában adjuk a tenyészethez (200 ml/adalék). A tenyészet térfogata nem változik, mert a víz elpárolgása ellensúlyozza a hozzáadott mennyiségeket. A tápoldatkomponensek összkoncentrációja az adalékokkal együtt: dextrin 2,8%; glicerin 1,4%; élesztőkivonat 2,4% és CaC03 0,2%. 120 óra elteltével a tenyésztést befejezzük. 3. példa 5 db üvegfermentornak a 2. példa szerint kapott tenyészfolyadékát (5X8 liter) egyesítjük, hozzáadunk 48 liter acetont, az elegyet 25 °C-on egy órán át keverjük, majd centrifugáljuk. A tiszta, micéliummentes folyadékot 20—35 °C-on vákuumban mintegy 35 liter térfogatra betöményítjük, nátriumhidroxid-oldattal pH 9-re beállítjuk és 18 liter etilacetáttal extraháljuk. A szerves fázist 500 g nátriumszulfáttal szárítjuk, vákuumban mintegy 1 liter térfogatra betöményítjük, majd 2 liter ciklohexánt adunk hozzá. A keletkezett csapadékot szűrjük és levegőn szárítjuk. 12,5 g nyers antibiotikumot kapunk. 4. példa A tiszta antibiotikum kinyerése vékonyrétegkromatográfia segítségével. A 3. példa szerint kapott nyers antibiotikum vékonyrétegkromatogramjában az antibiotikum a 34 Rf értékű főzónában van (futtató elegy: 40 tf.-rész kloroform, 6 tf.-rész metanol és 1 tf.-rész 25%-os vizes ammónia-5 oldat elegye, Kieselgel-lemezek: Kieselgel 60 F25 4 , gyártja: Merck, Darmstadt, NSZK). Kipreparálás céljából 1,00 g nyers antibiotikumot 20 db 20X20 cm méretű, PSC F254 jelű Kieselgel-lemezen a fenti futtatóelegy segítségével futtatunk. A 0,34 Rf értékkel rendel-10 kező zónát izoláljuk. Hozam: 327 mg. 5. példa 15 A tiszta antibiotikum kinyerése oszlopkromatográfia segítségével. A 3. példa szerint kapott nyers antibiotikum 3,5 g-ját 100 cm hosszú, 5 cm átmérőjű, semleges géllel (Kieselgel 60, szemcseméret 0,063 alatt, gyártja: Merck, Darms-20 tadt, NSZK) töltött oszlopon a 4. példában megadott futtatóeleggyel kromatografáljuk. A 307 nm-nél abszorbeáló főfrakciót felfogjuk. Az eluátumot vákuumban bepároljuk és a maradékot etilacetát és petroléter elegyéből átkristályosítjuk, majd 100 °C-on és 0,01 Hgmm 25 nyomáson 4 napon át szárítjuk. Hozam: 1,8 g. 6. példa 30 A tiszta antibiotikum kinyerése Craig-féle megoszlatással. A 3. példa szerint kapott nyers antibiotikum 50 g-ját 250 cm3 fázistérfogatú készülékben (gyártja: Labortec F. Schmidiger cég, Basel, Svájc) Craig-féle megoszlatás-35 nak vetjük alá, amikor is oldószerként petroléter, etilacetát, dimetilformamid és víz 1,5: 8,5: 5 : 5 tf-arányú elegyét alkalmazzuk. 180 megoszlatási lépést végezünk, a 60. lépés után a felső fázist frakcionáltan kivesszük. Az antibiotikum a 21—68. frakcióban van. A felfogott 40 felső fázist vízzel mossuk, vákuumban szárazra pároljuk, majd 100 ml etilacetátot adunk hozzá. Az oldatból 1 liter dietiléter hozzáadásával az antibiotikumot kicsapjuk. A terméket szűrjük és 100 °C-on, 0,01 Hgmm nyomáson 4 napon át szárítjuk. 45 A példákban említett lemez-tesztet az alábbiak szerint végezzük (vö.: P. Klein, Bakteriologische Grundlagen der Chemotherapeutischen Laboratoriumspraxis, Springer kiadó, Göttingen [1957], 86. old.). Escherichia coli ATCC 9637 által fertőzött agar-50 lemezbe lyukakat sajtolunk. A vizsgálandó anyagot oldat alakjában a lyukakba adjuk, majd a lemezt 37 °C-on mintegy 16 órán át inkubáljuk. A hatékony vegyületek körül olyan zónák alakulnak ki, amelyekben a növekedés gátolt. A zóna méretéből az antibiotikum mennyi-55 ségére következtethetünk. Szabadalmi igénypontok 60 1. Eljárás új antibiotikum előállítására, mely antibiotikum (a) tapasztalati összegképlete C69 H g6 03 4 , (b) az 1. ábrán feltüntetett ultraibolya színképpel, a 65 2. ábrán feltüntetett infravörös színképpel és a 9
