171574. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkálifém- vagy ammónium-inzulin előállítására

5 171574 6 A cink-inzulin lúgos vizes oldatának más ismert elkészítési módja szerint a cink-inzulint körülbelül 8-9,5 pH-jú vizes lúgos közegben oldjuk, és a kapott oldat pH-ját körülbelül 7,6-8,6-ra állítjuk be. A kiindulási vizes oldat lúgosságát a fentiek 5 szerint szokásosan alkálifém- vagy ammónium-bázissal biztosítjuk. A lúgosság csökkentésére híg ásványi savat használhatunk, előnyben részesítve a sósavat és a foszforsavat. Megemlítjük még, hogy a cink-inzulinból töményebb oldatokat nehezebb elő- JQ állítani, mint hígabb oldatokat, a cink-inzulin lúgos oldatokban való korlátozott oldhatósága miatt. Az EDTA-t és az alkálifém- vagy ammóniumionokat szükség esetén bármikor hozzáadhatjuk az 15 oldathoz. Szokásosan az EDTÁ-t és az alkálifémvagy ammóniumionokat a pH végső beállítása előtt adagoljuk. A cink-inzulin lúgos vizes oldatának az elkészítése .után az alkálifém- vagy ammónium-inzulin 20 kikristályosodik az oldatból, szokás szerint környezeti hőmérsékleten, bár szükség esetén magasabb vagy alacsonyabb hőmérséklet is alkalmazható. Általában azonban a kristályosítási hőmérséklet kevesebb 30C°-nál. 25 Az alkálifém- vagy ammónium-inzulin így kapott kristályait a szakemberek előtt ismert bármilyen módszerrel izolálhatjuk. Jellemzően a kristályokat centrifugálással különítjük el és egymás után híg 30 alkálifém- vagy ammóniumsó-oldattal (szokásosan körülbelül 0,5 mólos, acetonnal, abszolút alkohollal és éterrel mossuk, majd a kristályokat vákuumban szárítjuk. 35 1. példa Körülbelül 7% marha- és 30% sertés-inzulinból álló 8 g cink-inzulint 400 ml savas fenolos vízben 40 oldunk (az utóbbi előállítása céljából 0,8 g fenolt 400 ml 0,01 n vizes sósavban oldunk). A kapott oldatot 4 egyenlő részre osztjuk és mindegyikhez 2,0 g nátrium-kloridot adunk (1—4. minta). Az alábbiak szerint 3 mintához etilén-diamin-tetraecet- 45 sav-tetranátriumsót (EDTA) adunk: 50 55 60 40%-os vizes nátrium-hidroxiddal mindegyik oldat pH-ját 8,2-re állítjuk be. A 2-4. mintában azonnal megindul a nátrium-inzulin kristályok kép- 65 EDTA Minta Mennyiség gramm Mól koncentráció 1 0 0 2 0,416 0,010 3 1,04 0,025 4 2,08 0,050 ződése. Az 1. mintából még 3 órás keverés után sem válnak ki kristályok. Az 1. mintát 0,1 mólos vizes EDTA-oldattal titráljuk, körülbelül 0,06 mólos EDTA-koncentrációnál megkezdődik a nátrium-inzulin kristályosodása. Mindegyik mintát éjszakán át keverjük. A nátrium-inzulin kristályokat ezután centrifugálással összegyűjtjük, egyszer acetonnal, kétszer abszolút alkohollal és egyszer éterrel mossuk. Vákuumban megszárítva a nátrium-inzulin kitermelése a következő: Nátrium-inzulin kitermelése Minta Gramm % E/mg I 1,705 85,2 25,6 2 1,842 92,1 25,0 3 1,929 96,4 23,5 4 1,971 98,5 23,5 A nátrium-inzulin hatásosságát (és a következő példákban előállított összes inzulinét) immunológiai próbával határozzuk meg G. W. Probst és munkatársai módszerével (J. Pharm. Sei., 55, 1408, 1966 .) A módszer standard deviációja ± 15—25%. 2. példa Marha-hasnyálmirigyből nyert 2g tisztított nátrium-inzulint - melynek aktivitása 27,0 E/mg és amely kisebb mennyiségű kevésbbé savas fehérjével szennyezett - 400,ml 0,5 n ecetsavban oldunk. A kapott oldathoz körülbelül 20 ml abszolút alkoholt és 0,4 ml 20% cink-klorid-oldatot adunk (40 mg cink-klorid per gramm inzulin). Az oldat pH-ját 20% ammónium-hidroxiddal 5,95-re állítjuk be és az oldatot lehűtve körülbelül 72 óráig 5 C°-on tartjuk. A képződött cink-inzulin kristályokat centrifugálással összegyűjtjük, egyszer desztillált vízzel mossuk és az 1. példában leírtak szerint elkészített 50 ml savas-fenolos vízben oldjuk. Az oldatot savas-fenolos vízzel 100 ml-re hígítjuk. A kapott oldathoz 2,0 g nátrium-kloridot (0,34 mólos nátrium-klorid-oldat formájában) és 0,208 g ÉDTÁ-t (0,005 mólos EDTA-oldat formájában) adunk. Az oldat pH-ját ezután 40% vizes nátrium-hidroxiddal 8,2-re állítjuk be. Ekkor megindul a nátrium-inzulin kristályok képződése, amely éjszakán át környezeti hőmérsékleten tovább folyik. A nátrium-inzulin kristályokat centrifugálással izoláljuk, majd az 1. példában leírtak szerint mossuk és szárítjuk. A nátrium-inzulin kitermelése 1,864 g (93,2%). A nátrium-inzulin aktivitása 27,0 E/mg. A nátrium-inzulin kiindulási anyag és a 2. példa végső nátrium-inzulinjának mintáit poliakrilamid gél-elektroforézissel elemezzük R. L. Jackson és munkatársai eljárását követve (Diabetes, 21, 235, 1972). 3