171544. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírus- és baktérium-vakcinák előállítására inaktiválással
5 171544 6 2. példa Az 1. példa szerint járunk el, azonban 0,03 térfogat% etilénimin helyett az alábbi anyagokat és koncentrációkat alkalmazzuk (1. ábra): 5 a) 0,5 térfogat% etilénimin (2. görbe), b) 0,05 térfogat% etiletilénimin (3. görbe), c) 0,05 térfogat% N-acetiletilénimin (4. görbe), d) 0,05 térfogat% 2,2'-dimetüetÜénimin (5. görbe), 10 e) 0,05 térfogat% izopropiletilénimin (6. görbe). A görbék az inaktiválás lejátszódását mutatják. Etilénimin használata esetén (2. görbe) 1,5 óra múlva íem mutatható ki fertőzőképes vírus, a többi anyag ísetén ezt az állapotot csak 7-8, illetve 11 óra múlva 15 Síjük el. 3. példa Az 1. példa szerinti eljárást megismételjük 22 C° 20 eakcióhőmérsékleten 37 C° helyett. Az idő előre laladtával a fertőzőképesség lineáris esését tapaszaljuk ebben az esetben is. 16 óra múlva már nem nutatható ki fertőzőképes vírus. 4. példa Az 1. példa szerinti eljárást megvalósítjuk 0t típusú MKS-vírus-oldat alkalmazásával. 4 órás reak- 30 cióidő után nem mutatható ki fertőzőképes vírus. 5. példa C és 0) típusú MKS-vírus-oldatokat az 1. példa szerinti eljárással 5, illetve 6 órán át inaktiválunk. Ezután az ismert polietilénglikol-eljárás segítségével (lásd az 1 261 673 sz. nagy-britanniai szabadalmi leírást) víruskoncentrátumokat állítunk elő belőlük, és ezekkel a koncentrátumokkal 5—5 fogékony malacot oltunk intramuszkulárisan l-l ml mennyiséggel. Miután 10 napon belül ezek nem mutatnak semmilyen betegségi tünetet, az inaktivált vírusleoncentrátumöt ugyanannyi rész DEAE-dextránnal, mint adjuvánssal keverjük össze és ezt 20 malacnak idjuk be intramuszkuláris injekció formájában. Az illatok az összes neutralizáló antitestet termelik mindkét aktív vírustípus ellen- 8 héttel a vakcinálás után 10 állat közül mind a 10 immúnis C-típusú aktív MKS-vírus fertőzésével szemben, 10 áüat közül 9 immúnis az 0i típusú MKS-vírus fertőzésével szemben, 1 állat megbetegedése lényegesen enyhébb, mint a kezelés nélküli kontroll állatok. 6. példa Az 1. példa szerinti eljárást az MKS-vírus helyett a fertőző szarvasmarha rhinotracheitis (IBR) vírusa 60 - amely a dezoxiribonukleinsavat tartalmazó vírusok egyik képviselője - inaktiválására használjuk (az MKS-vírus ribonukleinsavat tartalmaz). Itt is. meg-Eigyelünk egy lineáris fertőzőképesség titeresést, %y 6 óra múlva nem mutatható ki fertőzőképesség. A 65 6 órán át kezelt vírus-oldat 2 ml-ével 10 db fiatal tengerimalacot oltunk intramuszkulárisan. 3 héttel a vakcinázás után ezeknek az állatoknak a szérumában kimutathatók az IBR-vírussal szembeni neutralizáló antitestek. 7. példa Körülbelül 1010 baktérium/ml koncentrációjú Pasteurella haemolytica ATCC 14003 baktériumszuszpenzióhoz az 1. példában leírtakhoz hasonlóan 0,05 térfogat% végkoncentrációfe etilénimint adunk. Az elegyet 14 órán át 37C°-on tartjuk, majd a baktérium-masszát centrifugáljuk és steril, foszfáttal pufferolt nátriumklorid-oldatban újra szuszpendáljuk. Az így kapott készítmény egy mintáját 3 különböző baktérium-táptalajra oltjuk és 37 C°on tenyésztjük. 6 napon belül nem figyelhető meg baktérium-növekedés. Egy további minta 0,1-0,1 ml-ével intraperitoneálisan oltunk 20 db egeret. 24 és 48 óra múlva az állatok nem mutatnak megbetegedési tüneteket, míg 20 db, ugyanolyan, azonban kezeletlen baktérium-szuszpenzióval oltott állat közül 15 db 16 óra múlva és 5 db 24 óra múlva elpusztul. Egy további mintát ugyanolyan térfogatmennyiségű adjuvánssal keverünk össze. Adjuvánsként alumíniumnidroxidot alkalmazunk. Ennek a vakcinának 1,5-1,5 ml-ével 5 db házinyulat oltunk szubkután. 14 nap elteltével ugyanazzal a mennyiséggel elvégezzük a boost er-oltást, azaz a vakcinázás ismétlését (booster-oltás: az indító dózis beadagolása után újabb antigén-dózis beadása, amely révén nagymennyiségű antitest igen gyors termelése idézhető elő, lásd: Dictionary of Immunology, W.J. Herbert and P.C. Wilkinson, Blackwell Scientific Publications Ltd., 28. oldal). Az állatok közül egy sem mutat baktériumvérűséget. Az állatok szérumában az agglutinációs próba segítségével ugyanezen baktériummal szemben kimutatható antitest-titer, a booster-oltás után jelentősen megnő. 8. példa Inaktiváló kísérletek Az inaktiválást egyszer a találmány szerint, azaz etiléniminnel, másrészt az inaktiválószerként ismert [Zentralblatt für Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten und Hygiene, I. kötet, 213 (3), 285-297. old. (1970)] etiletiléniminnel végezzük. Általános leírás: etilénimin (El), illetve etilénimin (EEI) 2%-os vizes oldatának pH-értékét sósavval a mindenkori inaktiválási folyamat optimális értékére állítjuk be. Ez az optimális pH-érték az inaktiválandó vírus pH-stabilitásából, valamint az etilénimin, illetve etiletilénimin pH-stabilitásából adódik. A vizes etilénimin- illetve etüetilénimin-oldatot a kívánt végkoncentrációjg a rrákroprganizmus-szuszpenzióhoz (vírus- vagy baktérium-szuszpenzióhoz) adagoljuk. Az 3
