171512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nikotinamid-adenin-dinukleotid-származékok előállítására
5 171512 6 400mg nátriumditiorútot adunk hozzá, és forró vízben 5 percig melegítjük, hogy a IV általános képletű vegyületet (R = H) megkapjuk. Gyors hűtés után levegőt buborékoltatunk 15 percig az oldaton át, s így elbontottuk a fölösleges nátriumditionitot. 5 Az oldat ultraibolya spektruma 259 nyi-nál csúcsot és 267, valamint 290 mju-nál két emelkedést mutat, és a 340 m/z-nál megjelenő új abszorpciós csúcs a nikotinamid-csoport tényleges redukciójára utal. 10 Az oldat pH-ját 1 n nátriumhidroxid-oldattal 11,2-es értékre állítjuk be és az oldatot 75Cc -on melegítjük egy órán át, majd lehűtjük szobahőmérsékletre, ily módon állítjuk elő az V általános képletű vegyületet (R = H). 15 Az oldat ultraibolya spektrumában nemcsak a 340 mju-os csúcs jelenik meg, hanem mivel a 259 m/z-os csúcs, valamint a 290 m/u-os meredekség is eltűnik, egy új csúcs is kialakul 267 mju-nál, amely tipikusan jellemző a 6-os helyzetű amino- 20 -csoportján alkilezett adeninra. Az oldathoz 3 ml 3 mólos TRIS puffer-oldatot [trisz(hidroxi-metil)-amino-etán-hidroklorid és sósav keverék] adagolunk, 6 n sósavval beállítjuk a pH-t 7,5 értékre és végül 0,5 ml acetaldehidet és 100 ml, 4,8 n ammó- 25 niumszulfáton (2 g, 4 mg enzim/ml oldat koncentrációval) élesztő oldat formájában alkohol dehidrogenázt adunk az elegyhez. Az elegyet szobahőmérsékleten és sötét helyen 30 40 percig ülepedni hagyjuk. Az oldat ultraibolya spektruma mutatja a 267 m/i-os csúcsot, de ugyanakkor eltűnik a 340 m/i-os abszorpciós csúcs, ami a nikotinamid-csoport teljes újraoxidációját bizonyítja. 6 n sósav- 35 val 3 pH-ra való savanyítás után 10 térfogatrész acetonnal csapadékot választunk le, és egy éjszakán át -20 C°-on ülepedni hagyjuk. Majd az olajos csapadékot összegyűjtjük és 100 ml kétszer desztillált vízzel hígítjuk és a pH-t 1 n nátrium- 40 hidroxid-oldat adagolásával 8-ra állítjuk be és végül 40 ml karboxil anion cserélő műgyantát tartalmazó kromatográfiás oszlopra visszük fel. Ezután 100 ml kétszer desztillált vízzel, majd 0,075 mól hangyasawal tovább hígítjuk mindaddig, 45 amíg az oldatból eltűnik a 260 m/z körüli abszorpciót mutató termék. Az ezután következő 0,2 mól hangyasavval való hígítás (1,5 liter) után a VI általános képletű NAD-származékot (R = H) össze lehet gyűjteni. 50 Liofilizálással történő 1/10 térfogatra való koncentrálás, 10 térfogat acetonnal való lecsapás, egy éjszakán át kb. -20 C°-on történő ülepítés és a centrifugálás után 190 mg VI általános képletű 55 tiszta NAD-származékot (R = H) gyűjtünk össze. A kapott termék ultraibolya spektruma: *max211 (e29,600M"1 AmaX 267 (e23,600 M _I \nin235 (e8,100 M' 1 cm" 1 ). cm "'), cm"1 ), 60 tatószer: (a) izovajsav-víz-32%-os vizes ammónia-oldat (66 : 33 :1,7, térfogatra számítva), Rf =0,23 (NAD 0,37), (b) TRIS puffer (0,5 mólos) pH = 8, Rf =0,71 (NAD 0,65). Nagyfeszültségű elektroforézis Whatman 3 MM papíron, 0,02 mólos ammóniumacetát elektrolittal, pH = 5,0, a foltok ultraibolya lámpával 254m/i-nál láthatók. Nagyobb mozgékonyság észlelhető az anód felé, mint a NAD esetében, ami karboxilcsoport jelenlétét valószínűsíti. Elemzés a C25 H 3 30 17 P 2 képlet (molekulasúly: 819.58J alapján: számított: C =36,63%, H = 4,79%, N =11,96%, P = 7,55%, talált: C =36,88%, H = 4,60%, N =11,85%, P = 7,10%. Vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatot végeztünk szilikagélen, fluores/cencia előhívással, a foltok ultraibolya lámpával 254 m/i-nél voltak láthatók. Fut- 65 NMR vizsgálat deuterobenzolban, pH = 7,5, tetrametil-szilán belső standarddal: 62.54 (2H, m, CH2 -COOH), 3.60 (2H, m, NH-CHi), 4.10-4.53 (IH, m, CH-OH). Valamennyi egyéb adat a NAD-nak felel meg. 13C NMR vizsgálat 2H 2 O-ban, pH =7,5, tetrametil-szilán belső standarddal: S 179.31 (COOH), 67.98 (CH-OH), 46.05 (NH-CH2 ), 42.35 (CH 2 -COOH). Valamennyi egyéb adat a NAD-nak felel meg. 4. példa Nikotinamid-6-(2-hidroxi-3-karbometoxipropilaminp)-pur in-di nukleot id (VI általános képletben R= -CH3) előállítása 1 g NAD-t 5 ml kétszer desztillált vízben oldunk és 1 n nátriumhidroxid-oldattal beállítjuk a 6-os pH-t, és 5,25 g 3,4-metilepoxibutanoátot adunk hozzá. A reakcióelegyet tartalmazó edényt a fénytől óvjuk és pH-mérőhöz csatlakoztatott mágneses keverővel és 1 n perklórsavval automata bürettával látjuk el, így a reakció folyamán az elegy pH-ját 6-os értékben tartjuk. 4 napig tartó szobahőmérsékletű keverés után a reakció teljesen végbemegy, és perklórsavval való savanyítás és 10 térfogatrész acetonnal való lecsapás és egy éjszakán át -20 C°-on végzett ülepítés után a III általános képletű (R = -CH3) terméket gyűjtjük össze. A maradék acetont forgó párologtatóval távolítjuk el. Az ultraibolya spektrumból következtetünk a szerkezetre. A csapadékot 60 ml 1%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldatban oldjuk, 400 mg nátriumditionitot adunk hozzá, forró vízben melegítjük 5 percig, majd gyorsan lehűtjük és 15 perces levegőfúvatás után megkapjuk a IV általános képletű vegyületet (R = -CH3). Ultraibolya spektruma utal a szerke-3
