171383. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunogén anyagok elkülönítésére Pasteurella Haemolytica vagy Pasteurella multocida törzsekből és ezeket tartalmazó vakcina előállítására
9 171383 10 vakcinához, Clostridium septicum vakcinához vagy „Plurovax" vakcinához (borjú-pneumónia vakcina, a The Wellcome Found., Ltd. cég terméke) adhatjuk A találmány szerint előállított vakcinákat emlősöknek vagy szárnyasoknak adhatjuk be a 5 pasteurella-fertőzések elleni immunizálás céljából. Egyes esetekben az endotoxin-mentes felső folyadékfázisból nem szükséges kicsapni az immunogén anyagot. így például, ha az endotoxin 10 kicsapásához etanolt használtunk fel, az endotoxin-mentes folyadékfázist bepárolhatjuk, vagy az etanol főtömegét elkülöníthetjük. így az immunogén anyag oldatához jutunk, amelyet megfelelő hígítás után az immunogén anyag szilárd formában 15 való elkülönítése nélkül, közvetlenül felhasználhatunk injekciós készítmény előállításához. Szakember számára az is nyilvánvaló, hogy az endotoxin-mentes immunogén anyagot más ismert 20 módszerekkel is elkülöníthetjük a tokos P. multocida vagy P. haemolytica sejtek tenyészeteiből, így például, ha kiindulási anyagként B vagy E típusú sejteket használhatunk fel, a tenyészetet célszerűen a sejtoldódás megkezdődése előtt 25 centrifugáljuk, és így eltávolítjuk a sejteket és az egyéb oldhatatlan anyagokat, majd az immunogén hatóanyagot hosszú-szénláncú kvaterner ammónium-vegyülettel, például cetil-piridinium-bromiddal kicsapjuk. Eljárhatunk úgy is, hogy a centrifugálás 30 után kapott folyadékfázist elektroforetikus frakcionálásnak vetjük alá. A fentiek szerint elkülönített immunogén anyagot profilaktikus célokra további tisztítás nélkül közvetlenül injekciós készítményekké ala- 35 kíthatjuk. Ez elsősorban akkor előnyös, ha a további tisztítási lépések nagymértékben megnövelnék a vakcinagyártás költségeit. Kívánt esetben azonban az immunogén anyagot a vakcinák előállítása előtt vagy analitikai célokra tovább 40 tisztíthatjuk. Az egyéb módszerekkel, például a korábbiakban ismertetett oldószeres frakcionálással elkülönített immunogén anyagok tisztításához előnyösen hosszú-szénláncú kvaterner ammóniumvegyületeket 45 használhatunk fel. E vegyületek közül különösen előnyös a cetil-piridinium-klorid. A hosszú szénláncú kvaterner ammóniumvegyületet addig adjuk az immunogén anyag dializáit, sómentes oldatához, amíg csapadék nem válik ki. A csapadékot ismert 50 módon, például centrifugálással elkülönítjük, majd viszonylag tömény sóoldatban, például 3 mólos vizes nátriumklorid-oldatban oldjuk. Az oldatot a hosszú szénláncú kvanterner ammóniumvegyület kikristályosodásáig hűtjük, majd a kristályos 55 anyagot — például szűréssel — elkülönítjük. így a tisztított immunogén hatóanyag oldatához jutunk. A tisztított immunogén anyagot ismert módszerekkel, például a korábban már ismertetett, a 60 tisztítatlan immunogén anyag elválasztásánál közölt módszerekkel különíthetjük el. Eljárhatunk például úgy, hogy az oldathoz az immunogén anyag kiválásáig primer alkoholt, előnyösen metanolt adunk. 65 A találmány szerinti eljárással tehát az immunogén hatóanyagon kívül emlősök vagy szárnyasok P. multocida vagy P. haemolytica eredetű pasteurella-fertőzés elleni immunízálására alkalmas steril vakcinákat is előállíthatunk. Ezek a vakcinák a korábban ismertetett jellemzőkkel rendelkező immunogén anyagot tartalmazzák gyógyászatilag elviselhető hordozóanyagokkal együtt. A vakcinák sterilek és az immunizálandó emlős vagy szárnyas vérével izotóniásak. A vakcinák - az elérni kívánt immunitástól függően - P, multocida A vagy D típusú (Carter-rendszer), III vagy IV típusú (Roberts-rendszer) vagy I vagy III típusú (Little—Lyon rendszer) változataiból elkülönített immunogén anyagot tartalmazhatnak. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa Immunogén anyag elkülönítése B-típusú tokos P. multocida sejtekből Vérmérgezésben szenvedő, fertőzött szarvasmarha vérét, amely a Pasteurella multocida 52 törzs B típusú élő sejtjeit (WCC-6864) tartalmazza, felhasználásig ampullában folyékony nitrogénben tároljuk. Felhasználáskor az ampulla tartalmát dextróz-keményítő-agar lemezre (Difco) kenjük fel. Az átlátszó agar-lemezt ferde fénysugárral megvilágítjuk, és a fölülről szemlélve fényvisszaverő tokos telepeket elkülönítjük. Néhány így elkülönített telepet 10 ml Oxoid (az Oxoid Ltd., London cég terméke) táptalajon tenyésztünk. Az elegyet 6 órán át 37 C°-on tartjuk, közben időnként összerázzuk. Ezután a tenyészetből 1 ml-t elkülönítünk, és 100 ml táptalajon tovább tenyésztjük. 9 óra elteltével az így kapott tenyészetet 5 liter, az alábbi összetételű steril táptalajhoz adjuk: ökör-hasnyálmirigy autolizátum 125 ml glükóz 3g vas(III)-citrát -6H2 0 0,1 g NaH2 P0 4 • 12H 2 0 19 g KH2 P0 4 (vízmentes) 2,5 g K2 HP0 4 (vízmentes) 9,2 g tápoldat ad 1 liter pH = 7,1-7,4 A táptalajt EKS-szűrőbetéten (a Gallenkamp. London cég terméke) szűrve sterilizáljuk. A tenyészetet 2 liter/perc sebességgel levegőztetjük, és az elegyhez a habzás meggátlása érdekében 20 ml Antifoam A (a Dow-Corning, Reading cég terméke) kereskedelmi nevű szilikon-alapú habzásgátlót adunk. A növekedést a 6., 7 és 8. órában ellenőrizzük. Amikor a növekedés sebessége (turbidimetriásan meghatározva, OD570 nm értékekben) 5
