171339. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12-vitamin tartalmú fermentlevek feltárására és sejtmentesítésére
5 171339 6 vonatból a hatóanyagot 2-es pH-érték mellett fullerföldön adszorbeáltatják, majd alkálifémcianidos, ammóniával lúgosított alkohollal eluálják. Az alkoholos eluátumot semlegesítik, vákuumban bepárolják, majd a sűrítményt az eredeti vizes kivonat l / 70 -ed részére hígítják vissza. Ily módon barnásszínű, zavaros, szűréssel és centrifugálással tisztíthatatlan, sok kolloid szenynyezést tartalmazó vizes oldatot kapnak. A kolloidok eltávolítására 30 tf% 3,3%-os ólomacetát-, majd ezt követően 10 tf% 5%-os alumíniumszulfát oldatot adnak hozzá (pH-érték 5,6). Ezután az oldatot 1 tf% 10%-os nátriumcianid oldattal elegyítik, majd a pH-értéket 8,5-re állítják és 40 Cc -ra melegítik. A felülúszót elválasztják, de a visszamaradt jelentős mennyiségű hatóanyag kinyerése céljából a műveletet a csapadékkal meg kell ismételni. A két felülúszót egyesítik, ily módon a kiindulási koncentrátumban jelenlevő hatóanyag 94%-át nyerik ki. A 144 389 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás eljárást ismertet mikroorganizmusoknak fermentleveikből történő koagultatására, oly módon, hogy a mikroorganizmusokat a fermentlevekben in statu nascendi képzett csapadékkal agglutinálják, majd a csapadékot elkülönítik. Az eljárás különleges előnye, hogy az ily módon végzett koaguláltatás a mikroorganizmusok életképességét nem befolyásolja, azaz az így kapott csapadék oltóanyagként közvetlenül felhasználható. A csapadék képzéséhez két komponens szükséges: az egyik lehet maga a fermentlé, vagy a megfelelő pH-értékre beállított fermentlé, a másik komponens az utólag bevitt megfelelő fém-só oldat. A találmány szerint először azt a komponenst adják a fermentléhez, amelyik a fermentlé pH-értékét alkalikus irányban tolja el, azaz a csapadék mindig pH-érték csökkenés mellett képződik. Csapadékképző ágensként általában a II. és III. osztályú kationok vízoldható sóit alkalmazzák. Az 1 291 149 lajstromszámú brit, valamint az annak megfelelő 2 053 763 lajstromszámú német szövetségi köztársaságbeli és a 275 308 lajstromszámú szovjet szabadalmi leírás igen jelentős eljárást ismertet a B-vitamin férmenfléből történő kinyerésére, mi mellett a legfrissebb összefoglalót és értékelést adja az eddig ismert eljárásokról. A szabadalmi leírás szerint a B12 -vitamint tartalmazó sejtek feltárására és a B 12 -vitamin kivonására használt módszerek többsége nem bont el minden kötést a B12 -vitamin és a sejtszerkezet között. Ezért ebben a lépésben igen jelentős a veszteség (a kezdeti koncentráció 40—50%-a). A B12 -vítamin kinyerésére legjobb módszernek a cianidok jelenlétében végzett autoklávozást tartják ugyan, de ez az eljárás ipari méretekben csak nehezen valósítható meg. A B12 -vitamin előállítására termofil metántermelő vegyes populációt, vagy Propionibacterium shermanii fermentációs tenyészetét, vagy sejtsűrítményeit használják. A találmány szerint a sejtek feltárását különleges feltáró reagensek és stabilizáló szerek jelenlétében végzik: 0,5 s% klóramin B-t és/vagy 0,25 s% klóroszukcinimidet mint feltáró és 0,5% ammóniumrodanátot mint stabilizáló reagenst alkalmaznak 95^98 C°-on, 4-es pH-értéken, 1 órán át. Ezután a termofil metán fermentáció feltárt fermentlevét 2,5—2,7 pH-értékre savanyítják, majd a szilárd részek leülepedése után a felülúszót dekantálják, amely a B12-vitamin 98,3%-át tartalmazza. A Bi2 -vitamint, illetőleg egyéb korrinvázas vegyületeket tartalmazó fermentlevek feldolgozására irányuló eljárásokról összefoglalóan megállapíthatjuk, hogy rendkívül szerteágazó megoldások célozzák ezen igen értékes vegyület minél hatásosabb kinyerését: a sejtek lízisét kénsavval, Ca(OH)2 -dal, vízzel elegyedő vagy nem 5 elegyedő szerves oldószerekkel, mint például aceton, butanol, toluol segítik elő. Egyes esetekben a sejtek hatásos szétroncsolására különleges vegyszereket alkalmaznak, mint például krómsavat (Cr03 ), nátriumditionitot, klóramin-B-t vagy klórszukcinimidet. Más 10 eljárásokban stabilizáló szereket alkalmaznak, mint például cianid-, rodanid-, szulfit-, hidroszulfit-, vagy nitritiont. Ismeretes olyan eljárás is, amely szerint egyszerűen vízzel, emelt hőmérsékleten, célszerűen autoklávozással tárják fel a sejteket. A lízissel vagy 15 feltárással egyidejűleg az elroncsolt sejtek eltávolítása céljából rendszerint szűrési segédanyagokat, mint például fullerföldet, II. vagy III. osztályba tartozó fémionokat, mint például ólom-, vas-, alumíniumionokat adnak a fermentléhez, de szerves oldószerrel is agglu-20 tinálják a feltárt sejteket. E rendkívül sok eljárás arra utal, hogy a feladatot — különösen a magas sejtszámú, azaz nagy B12 -vitamin tartalmú fermentlé esetében — kielégítő módon, azaz egyszerűen és gazdaságosan ez ideig nem sikerült meg-25 oldani. A találmány célkitűzése az eddig ismert B12 -vitamint tartalmazó fermentlé feldolgozásoknál egyszerűbb és hatékonyabb eljárás kidolgozása, amely a legkülönbözőbb eredetű és koncentrációjú B12 -vitamint tartalmazó 30 fermentlevek szakaszos vagy előnyösen folyamatos feltárását és sejtmentesítését oly módon biztosítja, hogy egyben a további feldolgozási lépések is egyszerűsödnek. Kísérleteink során azt találtuk, hogy abban az eset-35 ben, ha a fermentlevét első lépésben gyengén alkalikus közegben, szűk pH-érték tartományon belül valamely cianid-só és/vagy valamely ciánhidrin jelenlétében emelt hőfokon megfelelő ideig kezeljük (feltárjuk), majd következő lépésben az így feltárt fermentléhez vas(III)-40 -klorid oldatot adunk, rövid ideig a feltárt sejteket a vas(III)-klorid hatására koagulálni hagyjuk és ezután a közeget valamely bázissal szűk pH-érték tartományon belül enyhén meglúgosítjuk, abban az esetben az eddig ismert legmagasabb B12 -vitamin tartalmú és a legnehe-45 zebben feltárható fermentlevekből hígítás nélkül is az analitikai módszerekkel meghatározható B12 -vitamin mennyisége gyakorlatilag veszteségmentesen, mennyiségileg kinyerhető anélkül, hogy többszöri feltárást kellene alkalmazni. A fenti módon képzett vas(III)-50 -hidroxid csapadék igen könnyen szűrhető, nem adszorbeál Bi2 -vitamint, illetőleg az kevés vízzel kimosható mellőle és az így kapott szüredék tükrösen tiszta. Azt találtuk továbbá, hogy az ily módon feltárt és sejtmentesített fermentlé a további feldolgozás folyamán is 55 több előnyt mutat, így például az extrakció során nem képződik emulzió, a vizes és szerves fázis könnyen szétválik, mert a sejtmentesített fermentlé kolloidmentes, nem tartalmaz lipoidokat és lipoproteideket. Az eljárás különlegesen alkalmas a nehezen kezelhető metán-60 termelő vegyes populációkkal végzett szeptikus, adott esetben dúsított fermentlevek feldolgozására. Azt találtuk továbbá, hogy amennyiben a fermentlevét a vas(III)-klorid hozzáadása után első lépésben valamely alkáliföldfémhidroxiddal, előnyösen kalcium-65 hidroxiddal, majd valamely alkálifémhidroxiddal, elő-3
