171243. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új dotriakontapeptidamidok előállítására

15 171243 16 f —Cys—Met—Leu—Gly—OH-t (2 050 434 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali irat), 113 mg H—Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Thr(tBu)— —Gin—Asp(OtBu)—Phe—Asn—Lys(Boc)—Phe— 5 —His—Thr(tBu)—Phr—Pro- Gin—Thr(tBu)—Asn— —Thr(tBu)—Gly—Val—Gly— Ma—Pro—NH2-t (1. példa p) eljárása) és 10,5 mg N-hidroxi-szukcinimidet 0,9 ml dimetil-formamidban oldunk. 14 mg diciklohexil-karbodiimid hozzáadása után a lombikot nitrogén-gáz- 10 zal kiöblítjük, majd lezárjuk és 3 és 1/2 óra hosszat 45 C

C hőmérsékleten keverjük. A nyers terméket 15 ml peroxidmentes éter hozzáadásával kicsapjuk és Craig-extrakcióval metanol, puffer, kloroform, szén-tetraklorid 11:3:6:7 rendszerben (puffer az 1: példa k) eljárásánál 15 megadott) 240 szakasznál több, egyenként 3 ml fázistérfogattal tisztítjuk. A tiszta terméket a 108—129 számú frakciókból (rmax

= 118; K = 0,97) bepárlással és a puffer kiszublimálásával, mint amorf port kapjuk. DS: Rf(52) = 0,29; Rf(70)=0,65; Rj(100)=0,38. 20 3. példa 25 Bmp—Gly—Asn—Leu—Ser—Thr—Cys—Val— —Leu—Gly—Lys—Leu—Thr—Gin—Asp—Phe— —Asn—Lys—Phe—His—Thr—Tyr—Pro—Gin— —Thr—Asn—Thr—Gly—Val—Gly—Ala—Pro— 30 ^-NH2

—hidroklorid, . (Dezamino—Cys1

—Val

8

—Lys

11

—Leu12—Tyr22— —Asn26

—Thr

27

—kalcitonin M hidroklorid) F 50mg Bmp—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)—Thr(tBu)— 35 —Cys—Val—Leu—Gly—Lys(Boc)—Leu—Thr(tBu)— —Gin—Asp(OtBu)—Phe—Asn—Lys(Boc)—Phe— —His—Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Pro—Gin—Thr(tBu)— —Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2-1 40 az I. példában leírt eljárás szerint acidolízissel 12 n sósav-oldatban 0 °C hőmérsékleten a címben megadott peptiddé alakítunk. DC: Rf(101A)=0,51; Rf(112E)=0,45 Vékonyréteg-elektroforézis: pH 1,9; 16 volt/cm; 45 1 1/2 óra; futási távolság a kátédhoz körülbelül 3,7 cm. A védett dotriakontapeptidamidot például a következő módon állíthatjuk elő: a) Z—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe— 50 —OMe 4,15 g H—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe—OMe-t [Helv. 53, 2135 (1970)] 40 ml dimetil-formamidban oldunk, 3,26 g Z—Leu—ONp-t adunk hozzá és egy éjjé- 55 len át 22 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. A keletkezett pentapeptid víz hozzáadásával kikristályosodik, majd metanol, kloroform, petroléter elegyből és metanol, víz elegyből átkristályosítva tisztítjuk. Olvadáspont: 204 °C. 60 DS: Rj(kloroform, metanol 9:1)= 0,39; Rj<89)=0,52. b) H—Leu—Thr(tBu)—G-ln—Asp(OtBu)—Phe— —OMe 65 4,8 g Z-pentapeptidet 100 ml metanolban szokásos módon telítésig hidrogénezünk, majd a katalizátort leszűrjük és az oldatot szárazra pároljuk. A bepárlással amorf, fehér habos anyagot kapunk. DS: Rf(kloforom, metanol 9:1) = 0,14; Rj<89)=0,29 c) Z—Lys(Boc)—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu) —Phe—OMe 4 g H—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe— —OMe-t 3,5 g Z—Lys(Boc)—ONp-t 25 ml dimetil-formamidban oldunk és egy éjjelen át 22 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. A keletkezett hexapeptidet éter hozzáadásával mint kocsonyás anyagot kicsapjuk és metanol, etil-acetát, petroléter elegyből átkristályosítva tisztítjuk. Olvadáspont: 211—212 °C. DS: Rfíkloroform, metanol 9:1) = 0,50; Rf

(89)=0,55 d) Z—Lys(Boc)—Leu—Thr(tBu)—Gin— —Asp(OtBu)—Phe—NHNH2 Az előbbi 5 g metil-észtert melegítéssel 50 ml dimetilformamidban oldunk, 5 ml hidrazin-hidrátot adunk hozzá és 5 óra hosszat 22 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. Az anyagot 250 ml víz hozzáadásával kicsapjuk, a finom porszerű csapadékot leszűrjük és vízzel Folinnegatív reakcióig mossuk. Olvadáspont: körülbelül 220 °C (bomlik). DS: Rf(kloroform, metanol 9:1)=0,24; Rf

(89)=0,27 e) Z—Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Pro—Gin— —Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala— —Pro—NH2 393 mg 2-Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Pro—OH-t (2 050 434 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali irat) és 66 \ú N-metil-morfolint 5 ml tetrahidrofuránban oldunk, — 20 °C hőmérsékletre hűtjük és egy perc alatt 82 \L\ izobutil-klór-karbonátot adunk hozzá. A reakcióelegyet még 10 percig —15 °C hőmérsékleten keverjük, majd 0 °C-ra lehűtött, 6 ml trifluor-etanol és kloroform (6:4) elegyben oldott 300 mg H—Gin— —Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala— —Pro—NH2-t (analóg az 1. példa

j) eljárásával) adunk hozzá. A reakcióelegyet egy óra hosszat 0 °C hőmérsékleten keverjük, egy éjjelen át 22 °C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd kocsonyaszerű massza képződéséig betöményítjük, melyet szén-tetraklorid és petroléter elegyből kicsapunk. A nyers terméket Craig-extrakcióval metanol, puffer, kloroform, szén-tetraklorid 10:3: :5:4 rendszerben (puffer az 1. példa k) eljárásában megadott) több mint 400 szakaszban, egyenként 3 ml fázistérfogattal tisztítjuk. A 118—143 számú frakciók (rmax

= 130; K = 0,48) szárazra történő bepárlásával és a puffer nagyvákuumban 40 °C-on történő kiszublimálásával a kromatográfiailag tiszta dodekapeptidet, mint amorf port kapjuk. DS: Rf(43C) = 0,42; Rf(52A) = 20,37; Rj<70)=0,65. f) H—Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Pro—Gin—Thr(tBu)— —Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2 8 ©