171243. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új dotriakontapeptidamidok előállítására
9 171243 10 konolaj vagy más ismert gyógyászati hordozóanyagok; A gyógyászati készítmények például mint liofilizátumok, vagy folyékony formában mint oldatok, szuszpenziók, emulziók, vagy mint spray kerülnek felhasználásra (lásd például a 2 212 315 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali irat). A készítmények adott esetben sterilizáltak lehetnek és/vagy segédanyagokat, mint konzerváló-, stabilizáló-, nedvesítő- vagy emulgeálószereket tartalmazhatnak. A készítmények még más gyógyászatilag értékes anyagokat is tartalmazhatnak. A találmányt a következő példákban írjuk le. A vékonyréteg-kromatográfiában a következő rendszereket alkalmazzuk: 43C rendszer: terc-amil-alkohol, izopropanol, víz (51:21:28) 45 rendszer: szek-butanol, 3%-os vizes ammónia (70:30) 52 rendszer: n-butanol, jégecet, víz (75:7,5:21) 52A rendszer: n-butanol, jégecet, víz (67:10:23) 70 rendszer: etil-acetát, piridin, víz (40:20:40), felső fázis 89 rendszer: etil-acetát, aceton, víz (72:24:4) 96 rendszer: szek-butanol, jégecet, víz (67:10:23) 100 rendszer: etil-acetát, piridin, jégecet, víz (62:21:6:11) 101A rendszer: n-butanol, piridin, jégecet, víz (42:24:4:30) 102A rendszer: etil-acetát, metil-etil-keton, hangyasav, víz (50:30:10:10) 107 rendszer: etil-acetát, piridin, víz (49:24:27) 112E rendszer: n-butanol, piridin, hangyasav, víz (44:24:2:20) 121 rendszer: izopropanol, 25%-os vizes ammónia, víz (70:10:20) 121A rendszer: izopropanol, 25%-os vizes ammónia, víz (85:5:10) Rf-ádatok a vékonyréteg-kromatográfiáhöz: DS: szilikagél-készlemez SL 254; Antec cég, Birsfelden, DC: cellulóz-készlemez, Merck cég, Darmstadt, DA: Alox-lemez (45 g A120 3 Camag cég, Muttenz, + 3,5 g gipsz, vastagság 0,3 mm). A példákban a következő rövidítéseket alkalmazzuk: Boc terc-butil-oxi-karbonil-csoport, Z benzil-oxi-karbonil-csoport, OtBu terc-butil-észter-csopórt, ONp p-nitro-fenil-észter-csoport, OMe metil-észter-csoport, OSu hidroxi-szukcinimid-észter-csoport, tBu terc-butil-éter-csoport, Bmp ß-merkapto-propionil-csoport. 1. példa H—Cys—Gly—Asn—Leu—Ser—Thr—Cys—Met— —Leu—Gly—Thr—Tyr—Thr—Gin—Asp—Phe— —Asn—Lys—Phe—His—Thr—Phe—Pro—Gin— —Thr—Asn—Thr—Gly—Val—Gly—Ala—Pro— —NH2—hidroklorid (Asn26 —Thr 27 —kalcitonin M hidroklorid) 50 mg Boc—Cys—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)— —Thr(tBu)—Cys—Met—Leu—Gly—Thr(tBu)— —Tyr(tBu)—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu>—Phe—Asn— —Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)—Phe—Pro—Gin— 5 —Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala— —Pro—NH2-t 0 °C-on 1,2 ml vegytiszta 12 n sósavoldatban oldunk (idő 1—2 perc), nitrogéngázzal röviden átöblítjük és 10 percig 0 °C-on állni hagyjuk>.r Az elegyet ezután szárazjéggel lehűtjük, nagyvákuumban 10 evakuáljuk és a hőmérséklet lassú emelésével szirup sűrűségre bepároljuk. Az anyagot 2 ml vízben oldjuk, liofilizáljuk, a maradékot ismét 2 ml vízből liofilizáljuk és végül a levegő nedvességének felvételéig állni hagyjuk. Az így kapott termék az Asn26 -Thr 27 -kalcitonin 15 M hidrokloridja, mely amorf, vízoldható por. DC: R f(45) = 0,45; R f (101A)=0 > 53; Rf(112E)=0,39. A vegyület vékonyréteg-elektroforézisben (cellulózlemezen) 1,9 pH és 16 volt/cm-nél 1,1/2 óra alatt kö-20 rülbelül 3,7 cm-t vándorol a katódhoz. A védett dotriakontapeptidamidot például a következő módon állítjuk elő: 25 a) Z—Thr(tBu)—Gly—OMe 22,3 g Z—Thr(tBu)—OSu és 8,29 g H—Gly-^OMe— —hidrokloridot 100 ml dimetil-formamidban oldunk, illetve szuszpendálunk, 7,49 ml N-metil-morfolint adunk 30 hozzá, egy napig 22 °C hőmérsékleten keverjük, majd nagyvákuumban szárazra pároljuk. A maradékot etil-acetátban felvesszük, 5%-os citromsav-oldattal, 5%-os kálium-hidrogén-karbonát-oldattal és vízzel mossuk, nátrium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk. Az 35 olajos maradékot egy éjjelen át 0 °C-on állni hagyjuk, így az anyag kikristályosodik. Olvadáspont: 48 °C. A dipeptid kromatográfiailag egységes és így közvet-40 lenül tovább feldolgozható. DS: Rf(45) = 0,77; Rf(kloroform—metanol=9:l)= 0,70. b) H—Thr(tBu)—Gly—OMe—hidroklorid 45 5,0 g Z—Thr(tBu)—Gly—OMe-t 200 ml metanolban oldunk, majd 13,2 ml 1 n sósav-oldat és 0,5 g 10%-os palládium-csontszén hozzáadása után szén-dioxid-abszorpció közben telítésig hidrogénezzük. Az elegyet a 50 katalizátortól leszűrjük és szárazra pároljuk, így fehér habos anyagot kapunk. DS: Rf(45)=0,64; Rj(kloroform—metanol=9:l)= 0,41; Rf(52)=0,42. > 55 c) Z—Asn—Thr(tBu)—Gly—OMe 18,9 g Z—Asn—ONp-t és 12,5 g H—Thr(tBu)— —Gly—OMe—hidrokloridot 95 ml dimetil-formamid-60 ban oldunk, 4,6 ml N-metil-morfolint adunk hozzá és az elegyet 15 óra hosszat szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az oldószert nagyvákuumban eltávolítjuk, a maradékot etil-acetáttal eldörzsölve porítjuk és szűrjük, majd metanol—kloroform—petroléter elegyből és eta-65 nol—víz elegyből kristályosítjuk. 5
