171217. lajstromszámú szabadalom • Eljárás amiláz-inhibitor előállítására

Í712Í? 3 4 íryező színezékek igen erősen adszorbeálódnak az aktívszénen, lehetőség van hogy a fermentlevet savas pH-értékeknél ilyen fajta előzetes adszorpciónak vessük alá és ezáltal tisztább, nagyobb fajlagos aktivitású inhibitort nyerjünk ki az ily módon előzetesen tisztított léből. 5 (Az amiláz-inhibitor hatású anyagnak, valamint a szenynyező barna színezékeknek az említett savas illetőleg semleges pH-értékeknél a fermentlevekből bekövetkező adszorpcióját — 550 nm-nél mért extinkciójuk alapján — az 1. ábra szemlélteti.) 10 A fent leírt módon elkülönített variáns törzsek nem szükségképpen mutatnak mindenfajta tápoldatban az eredeti törzsénél nagyobb amiláz-inhibitor-termelő képességet. Azt tapasztaltuk azonban, hogy különösen nagy hozammal képződik az amiláz-inhibitor, ha a táp- 15 oldathoz szén forrásként 3% vagy ennél nagyobb mennyiségű keményítőt adunk. Különösen nagy hozamokat érünk el 4—6% keményítőtartalmú tápközeg alkalmazása esetén. Ha például oly tápközegben folytatjuk le a fermentá- 20 ciót, amely 2% keményítő mellett 1% glükózt, 0,5% kazein-hidrolizátumot, 1% élesztőkivonatot és 0,4% kalcium-karbonátot is tartalmaz, akkor 28 °C hőmérsékleten történő 3 napi fermentációval, az SE 50 törzs alkalmazása esetén 30 000—40 000 AIE/ml, az SE 50/13 25 törzs alkalmazása esetén pedig 50 000—60 000 AIE/ml inhibitor-tartalmú fermentlevet kapunk. Ezzel szemben, ha a tápközeg 5% keményítőt, 1% élesztőkivonatot és 0,2% dikálium-hidrogén-foszfátot tartalmaz, akkor 3 napi fermentáció után az SE 50 30 törzzsel 50 000—60 000 AIE/ml, az SE 50/13 törzzsel pedig 100 000—130 000 AIE/ml inhibitor-tartalmú fermentléhez jutunk. Az amiláz-inhibitor hozama tehát függ a tápközeg keményítőtartalmától. Körülbelül 5,5—6% keményítő- 35 tartalomig az amiláz-inhibitor termelése növekszik. Nagyobb keményítőkoncentráció esetén azonban a tápközeg viszkozitása oly mértékben megnövekszik, hogy emiatt másfajta káros befolyások, például a rossz oxigénellátás a fermentációs közegben, csökkentik az inhibitor- 40 hozamot. A fermentációhoz alkalmazott tápközeg egyéb alkotórészeinek mennyisége és minősége erősen ingadozhat, így például nitrogénforrásként kazein-hidrolizátum és élesztőkivonat együttes alkalmazása helyett csupán ezek 45 egyikének megfelelő mennyiségét is alkalmazhatjuk, vagy mindkettőt helyettesíthetjük valamely másfajta nitrogénforrással, például peptonnal is. A tápközegben jelenlevő puffer-rendszer, amely a 50 fent ismertetett tápközegekben kalcium-karbonátból ét káliumfoszfátból állt, szintén helyettesíthető más összetételű pufferrel. Csupán arról kell gondoskodni, hogy a fermentáció folyamán a pH-érték a fiziológiás határok között, tehát 5,0 és 8,5 között, előnyösen 6,0 és 7,8 kö- 55 zött maradjon. Ezt automatikus sav-lúg-adagolással is biztosíthatjuk. Kis koncentrációban másfajta cukrokat, például glükózt is adhatunk a tápközeghez; ezzel — különösen a kultúra fejlődési szakaszában — gyorsíthatjuk a fer- 60 mentációt. A fentiek során említett SE 50 törzset CBS 961.70 nyilvántartási szám alatt letétbe helyeztük a Centraalbureau voor Schimmelcultures (Baarn, Hollandia) intézet- 65 nél; ugyancsak letétbe helyeztük ennél az intézetnél a jelen találmány szerint alkalmazásra kerülő SE 50/13 törzset is, CBS 614.71 nyilvántartási szám alatt. Az amiláz-inhibitor-aktivitás meghatározása Az amiláz-inhibitor-egység (1 AIE) az az inhibitormennyiség, amely két amiláz-egység mennyiségű enzim hatását 50%-ban gátolja. Amiláz-egységen (1 AE) azt az enzim-mennyiséget értjük, amely az alább megadott kísérleti körülmények között, egy perc alatt 1 míkroekvivalens glükozid-kötést képes a keményítőben hasítani. Az így hasított kötések [i.Val-ban kifejezett mennyiségét a képződött jxVal redukáló cukor alakjában határozzuk meg kolorimetriásan, dinitro-szalicilsav segítségével; ezt azután egy maltóz-kalibrálási görbe segítségével [xVal maltóz-ek vi valens egységekben adjuk meg. E meghatározás lefolytatása céljából 0,1 ml amilázoldatot (20—22 AE/ml amiláz-aktivitással) alkalmazunk és ehhez 0—10 jxg inhibitort vagy 0—20 (xl vizsgálandó oldatot adunk 0,4 ml 6,9 pH-értékű pufferoldatban, amely 0,02 m nátrium-glicerofoszfát/0,001 m CaCl koncentrációjú. Ezt az elegyet azután körülbelül 10—20 percig 35 °C hőmérsékletű vízfürdőben tartjuk egyensúlybahozatal céljából. Ezután 0,5 ml 35 °C hőmérsékletre melegített 1%-os keményítőoldatot (Merck-féle oldható keményítő, 1252 sz.) adunk hozzá és 5 percig inkubáltatjuk 35 °C hőmérsékleten, ezt követően pedig 1 ml dinitro-szalicilsav-reagenst (P. Bernfeld szerint, Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol., 1. kötet, 149. 1.) adunk hozzá. A szín előhívása céljából az elegyet forrásban levő vízfürdőn tartjuk 5 percig, majd lehűtjük és 10 ml desztillált vizet adunk hozzá. Az extinkciót 540 nm-nél mérjük, ugyanígy összeállított, de amilázt nem tartalmazó vakpróbával összehasonlítva. Értékelés céljából azután egy előzetesen felvett amiláz-kalibrálási görbe segítségével megállapítjuk az inhibitor hozzáadása után még megmaradt amiláz-aktivitást és ezekből az értékekből kiszámítjuk a beadagolt amiláz gátlásának százalékarányát. A százalékos gátlást a ^.g inhibitor —— hányados függvényeként visszük fel a görbére (e hányadosban a számláló a szárazanyagra számított inhibitormennyiséget, a nevező pedig az inhibitor nélküli vakpróbában mért amiláz-aktivitást fejezi ki) és a görbéről leolvassuk az 50%-os gátlási pontot, amelyet azután AIE/mg egységekben kifejezett inhibitor-mennyiségre számítunk át. A találmány értelmében az említett nagy aktivitású inhibitor előállítása céljából az SE 50/13 törzset egy 5% keményítőt, 1% élesztőkivonatot és 0,2% dikáliumhidrogénfoszfátot tartalmazó tápközegben 28 °C hőmérsékleten 3 napig fermentáljuk rázólombikban vagy megfelelő nagyságú férmen torban. A fermentáció befejeztével a kapott barna színű fermentlevet színtelenítés céljából 1 : 1 hígítású salétromsavval 1 és 3 közötti, előnyösen 2 és 2,5 közötti pH-értékre állítjuk és literenként 2—10 g, előnyösen 5 g aktívszenet adunk hozzá. Ezután a micéliumot és az aktívszenet centrifugálással vagy szűréssel, esetleg valamely szűrési segédanyag hozzáadásával, eltávolítjuk, az így kapott tiszta, világossárga oldatot ammóniával semlegesítjük és a képződött inhibitor-aktivitást részleges bepárlás és alkohollal történő frakcionált lecsapás útján (a 20 64 092 német 2