171216. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szacharáz-inhibitorok előállítására
MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS Bejelentés napja: 1973. III. 1. (BA—2882) Elsőbbsége: Német Szövetségi Köztársaság: 1972. III. 1. (P 22 09 832.4) Közzététel napja: 1977. VII. 28. Megjelent: 1978. VI. 30. 171216 Nemzetközi osztályozás: C 07 G 7/00 C 07 B 7/00 Feltalálók: dr. Frommer Werner mikrobiológus, dr. Puls Walter orvos, dr. Schmidt Delf vegyész, Wuppertal, Német Szövetségi Köztársaság Tulajdonos: Bayer AG., Leverkusen, Német Szövetségi Köztársaság Eljárás szacharáz-inhibitorok előállítására i Ismeretes, hogy számos Actinomyces-nemzetségbeli mikroorganizmus — főképpen az Actinoplanaceák — glükozidhidroláz-inhibitorokat termel, és ezek az inhibitorok gátolják az emésztőtraktus szénhidráthasító enzimjeinek működését is. Az inhibitorok egy része hővel szemben viszonylag ellenálló és szobahőmérsékleten savval és lúggal szemben is stabilis. Az inhibitorok kémiai jellegüket tekintve oligoszacharidok, poliszacharidok vagy ezek származékai. A szóban forgó inhibitorok többnyire igen erősen gátolják az amiláz működését, szacharáz-inhibeáló tulajdonságaik azonban közepesek, vagy gyengék. A találmány tárgya eljárás a szóban forgó amilázinhibitorok átalakítására új, hatásos szacharáz-inhibitorokká. A találmány szerinti eljárás lényege az, hogy az amiláz-inhibitorokat enzimes úton vagy kémiailag lebontjuk. Az amiláz-gátló hatás mértékét az amiláz-inhibitor egységek számával adhatjuk meg. Egy amiláz-inhibitoregység (1 AIE) olyan mennyiségű inhibitort jelent, amely két amiláz-egységet 50%-osan gátol. Az amilázegység (AE) az amiláz olyan mennyisége, amely megadott vizsgálati feltételek mellett 1 perc alatt a keményítő mikroekvivalensnyi glükozid-kötését hasítja el. Az elhasított kötések mikroegyenértéksúlynyi mennyiségét a keletkezett cukor dinitroszalicilsavval végzett kolorimetriás meghatározása segítségével állapítjuk meg és maltóz-kalibrációs görbe felhasználásával mikroegyenértéksúlynyi maltóz-ekvivalensek formájában adjuk meg. 10 15 20 25 A vizsgálatot úgy valósítjuk meg, hogy 0,1 ml 20—22 AE/ml aktivitású amilázoldatot és 0—10 [xg inhibitort vagy 0—20 jxl inhibitor-hatás szempontjából vizsgált oldatot 0,4 ml olyan 6,9 pH-jú 0,02 m nátriumglicerofoszfátpufferrel elegyítünk, amely 0,001 m kalciumkloridot is tartalmaz, majd az elegyet 10—20 percen keresztül 35 C°-os vízfürdőn tartjuk. Ezután az oldatot 0,5 ml 35 C°-ra előmelegített 1%-os keményítőoldattal elegyítjük, az elegyet 5 percen keresztül ezen a hőmérsékleten inkubáljuk, végül pedig 1 ml dinitroszalicilsavreagenssel elegyítjük. Az 1%-os keményítőoldatot vízoldható keményítőből készítjük (a Merck, Darmstadt cég készítménye, N° 1252), a dinitroszalicilsav-reagenst R. Bernfield eljárása (Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol. /, 149. old.) szerint állítjuk elő. Az elegyítés után a szín kifejlesztésére az elegyet 5 percen keresztül forrásban levő vízfürdőn melegítjük, majd lehűtjük és 10 ml desztillált vízzel elegyítjük. Az oldat extinkcióját 540 nm-nél, amilázt nem tartalmazó összehasonlító reagens felhasználásával mérjük meg. A kapott extinkciós értéket előzetesen felvett amiláz-kalibrációs görbe segítségével állapítjuk meg: leolvassuk az inhibitor hozzáadása után még megmaradt amilázaktivitást és a kapott értékből kiszámítjuk az amiláz aktivitásának százalékos gátlását. A százalékos gátlást az alábbi képlettel számíthatjuk ki: (jig inhibitor AE 30 Az inhibitor mennyiségét a szárazanyagra vonatkozz 171216 1
