170786. lajstromszámú szabadalom • Eljárás MM-13902 antibiotikum-sók előállítására

27 170786 28 A közeget a fermentorban 20 percig 120 C°-os gőzzel sterilizáljuk. Az inokulum beadagolása után a tenyészetet 18 cm átmérőjű lapátos keverővel 140 fordulat/perc sebességgel keverjük, és a fermentorba 75 liter/perc sebességgel steril levegőt vezetünk. Az inkubálást 28 C°-on végezzük. 48 óra elteltével a fermentor tartalmát inokulumként egy 2000 literes rozsdamentes, zárt acél fermentorba töltött, 1500 liter térfogatú, alábbi összetételű táptalajhoz adjuk: szójababliszt („Arkasoy 50") glükóz-monohidrát lecsapott kalciumkarbonát kobaltklorid-hexahidrát vízmentes nátriumszulfát csapvíz 10,0 g/l 20,0 g/l 0,2 g/l 0,001 g/l 1.0 g/l ad 1500 liter Sterilizálás előtt a táptalaj pH-ját 6-ra állítjuk. Az elegyhez a habzás meggátlása céljából sterilizálás előtt 3 liter 10%-os szójaolajas „Pluronic L81" oldatot adunk. Sterilizálás után a táptalaj pH-ját steril nátriumhidroxid-oldat felhasználásával 7,0-ra állítjuk. Az inokulumot beadagoljuk, majd az elegyet két, egyenként 50 cm átmérőjű lapáttal felszerelt lapátos keverővel 106 fordulat/perc sebességgel keverjük, és a rendszerbe 1200 liter/perc sebességgel levegőt vezetünk. A fermentációt 30 C°-on végezzük. 60 óra elteltével a fermentációt leállítjuk, és a fermentlevet centrifugálással elkülönítjük. Az így kapott fermentlé aktivitását önkényesen 340 egység/ml-nek tekintjük. A fermentlé aktivitását a 2. példában leírt módszerrel vizsgáljuk. 1050 liter 10 C°-os, 8-as pH-jú szűrt fermentlevet (aktivitás: 340 egység/ml) 1200 g cetil-dimetil-benzil-ammóniumkloridot tartalmazó 310 liter 10 C°-os diklórmetánnal extrahálunk úgy, hogy a két folyadékot szabályozott sebességgel szivattyúzzuk át egy keverőberendezésen. A két fázist folyamatos üzemi „Sharples" centrifugával, körülbelül 2 perces centrifugálási idő betartásával választjuk el egymástól. A 300 liter térfogatú diklórmetános fázist vizes nátriumjodid-oldattal extraháljuk. Az extrakcióhoz négy részletben összesen 7 liter, 210 g nátriumjodidot tartalmazó vizet használunk fel. A két fázist fajsúlykülönbségük alapján választjuk el egymástól. A 7,7-es pH-értékű vizes fázist sósavval pH = 7,0-ra semlegesítjük, majd szűrjük. A kapott 7 liter térfogatú szürlet aktivitása 21 900 egység/ml. 10 cm átmérőjű üvegoszlopba 40 cm magasságig QAE Sephadex A25 gyanta (a Pharmacia Ltd. cég terméke) és 0,3 mól nátriumkloridot tartalmazó 0,05 mólos foszfátpuffer-oldat (pH = 7) keverékét töltjük. A kapott 7 liter térfogatú extraktumot 5 C°-ra hűtjük, és 50 ml/perc sebességgel bocsátjuk át a gyantaoszlopon. Az oszlopot 0,7 mól nátriumkloridot tartalmazó 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal(pH = 7)eluáljuk; az 5 C°-os pufferoldatot 25 ml/perc sebességgel vezetjük át az oszlopon. 2 liter eluátumot elöntünk, majd az eluátumot 90, egyenként 100 ml-es frakcióba gyűjtjük. A frakciók ultraibolya spektrumát felvesszük, majd a körülbelül 305 nm-nél elnyelési maximumot mutató frakciókat (azaz az 50—62. frakciót) egyesítjük. Korábbi kísérleteink során megállapítottuk, hogy ezek a frakciók MM 13902 antibiotikumot tartalmaznak. A kapott 1440 ml térfogatú, 71 000 egység/ml aktivitású frakció pH-ját 7-re állítjuk, majd az elegyhez 5 g/100 ml mennyiségű nátriumkloridot adunk, 5 C°-ra 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 hűtjük, és 20 ml/perc sebességgel egy 6,3 X 30 cm méretű, Amberlite XAD 4 gyantával (gyártja a Rohm and Haas Ltd.) töltött oszlopon bocsátjuk át. E körülmények között a gyantaoszlop az MM 13902 antibiotikumot megköti, a szervetlen szennyezőanyagokat azonban nem. Az MM 13902 antibiotikumot szobahőmérsékleten oldjuk le. Az eluálást 200 ml desztillált vízzel kezdjük, és 50%-os vizes metanollal folytatjuk. Az 1 liter térfogatú eluátumot csökkentett nyomáson, 30 C°-nál alacsonyabb hőmérsékleten 70 ml végtérfogatig bepároljuk, a koncentrátum pH-ját 7-re állítjuk, majd fagyasztva szárítjuk. 1,62 g barna, szilárd anyagot kapunk, amelynek aktivitása 37 000 egység/mg. Ez a termék az MM 13902 antibiotikum részlegesen tisztított dinátriumsója. 1,0 g részlegesen tisztított MM 13902 antibiotikum-dinátriumsót (aktivitás: 37 000 egység/mg) 3,8 X30 cm méretű, Whatman CC31 cellulózzal töltött oszlopon kromatografálunk, majd az oszlopot 2,5 ml/perc sebességgel 4:1 térfogatarányú n-propanol: víz eleggyel eluáljuk. 170 ml eluátumot elöntünk, és ezután az eluátumot 100 db, egyenként 15 ml térfogatú frakcióba gyűjtjük. Azokat a frakciókat, amelyek ultraibolya spektrum alapján MM 13902 antibiotikum-dinátriumsót tartalmaznak (azaz a 37—43. frakciót) egyesítjük, a 89 ml térfogatú oldatot csökkentett nyomáson, 30 C°-nál alacsonyabb hőmérsékleten n-propanolmentesre pároljuk. A maradékot fagyasztva szárítjuk. 219 mg sárgás, porszerű, 73 000 egység/mg aktivitású terméket kapunk. A kapott termék ultraibolya abszorpciós maektrumában körülbelül 308 nm-nél jelenik meg maximum (Ej cm ~ 343). A termék infravörös és NMR-spektruma megegyezik a 2., illetve 3. ábrán bemutatottal. A termék antibakteriális hatásvizsgálatának eredményeit a 10. táblázatban közöljük. 10. táblázat Az MM 13902 antibiotikum dinátriumsójának antibakteriális aktivitása (mikrotitrálási módszerrel, éjszakán át tenyésztett 1%-os tenyészet felhasználásával meghatározva) Mikroorganizmus MGK ng/ml Bacillus subtilis A 0,15 Staphylococcus aureus Oxford 0,3 Staphylococcus aureus Russell 0,6 Streptococcus faccalis 3,1 Enterobacter cloaceae Nl 25 Escherichia coli 10418 0,15 Escherichia coli JT410 5 Klebsiella aerogenes A 0,03 Proteus mirabilis 13 0,6 Proteus vulgaris WO 90 0,6 Proteus stuartii 0,07 Pseudomonas aeruginosa A 50 Salmonella typhimurium CT 10 0,3 Serratia marcescens US 39 2,5 Shigella sonnei 0,6—0,3 Haemophilus influenzae P6 0,08 Neisseria gonorrhoeae 0,08 14