170670. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típúsú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására
13 170670 14 10. példa N"-p-amino-Bz-Phe-Val-Arg-pNA -2 HCl (X) a) lépés Cbo-p-amino-Bz-Phe-Val-Arg(N02 )-pNA (Xa) Kiindulási anyagként 233 mg (0,33 mmól) (Ic) képletű vegyületet és 170 mg (0,44 mmól) Cbo-p-amino-Bz-OpNP-t (op.: 169—172 C°) használunk fel. A reak-10 15 20 25 elegy) egységes, [aß 3 == -32,8° (c=0,68, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Val: 1,0; Phe: 1,3; Arg: 1,0. 9. példa Na -Tos-Phe-Val-Arg-pNA • HCl (IX) a) lépés: N^-Tos-Phe-Val-ArgíNO^-pNA (IXa) Kiindulási anyagként 360 mg (0,5 mmól) (Ic) képletű vegyületet és 180 mg (0,95 mmól) 4-toluolszulfonilkloridot használunk fel. 360 mg (Ic) képletű vegyület 1 ml ecetsavval és 1 ml 5,6 n ecetsavas brómhidrogén-oldattal készített elegyét 1 órán át a nedvesség kizárásával szobahőmérsékleten keverjük. A reakcióelegyet erélyes keverés közben desztillált éterbe csepegtetjük. 350 mg H-Phe-Val-Arg(N02 )-pNA ••1,5 HBr válik ki. Az éteres fázist dekantálással elválasztjuk, a maradékot éterrel háromszor mossuk, majd vákuumban foszforpentoxid fölött szárítjuk. Az aminosav hidrobromidját kvantitatív hozammal kapjuk. A hidrobromidot 4 ml dimetilformamidban oldjuk, és az oldathoz -10 C°-on 75 mg (0,75 mmól) Et3 N-t adunk. Az elegyet 1 órán át a nedvesség kizárásával reagáltatjuk. A kivált Et3 N • HBr-t kiszűrjük, és a szűrlethez —10 C°-on 190 mg p-toluol-szulfonilkloridot adunk. Az elegyet lassan (kb. 3 óra alatt) szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni, majd ismét —10 Cc -ra hűtjük, és 25 mg (0,25 mmól) Et3 N-t adunk hozzá. Az Et3 N adagolását 2—3 óra múlva megismételjük. Összesen körülbelül 24 órás reakcióidő után az oldatot vákuumban 40 C°-on szárazra pároljuk, a maradékot desztillált vízzel háromszor eldörzsöljük, és vákuumban szárítjuk. A száraz maradékot metanolban oldjuk, és az oldatot metanollal egyensúlyba hozott Sephadex LH—-20 gélen szűrjük. 135 mg (36,5%) amorf (IXa) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pt elegy) egységes, [a]" = +o° (c .= 1,0, dimetilformamidban). b) lépés: N«-Tos-Phe-Val-Arg-pNA • HCl (IX) Kiindulási anyagként 81,43 mg (0,11 mmól) (IXa) képletű vegyületet használunk fel. A reakciót az 1. pél- 45 da g) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket 20%-os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen szűrjük. Az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 63 mg (78,4%) amorf, 4,79% klórtartalmú (IX) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtató- 50 szer: A elegy) egységes, [a]" = ±0 (c=0,73, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Val: 1,0; Phe: 1,2; Arg: 1,0. 30 35 40 55 60 65 ciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 55 mg (20%) amorf (Xa) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj elegy) egységes, [a]" = —30,2° (c = 0,53, dimetilformamidban). b) lépés: N^-p-amino-Bz-Phe-Val-Arg-pNA -2 HCl (X) Kiindulási anyagként 46,81 mg (0,056 mmól) (Xa) képletű vegyületet használunk fel. A reakciót az 1. példa g) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket 20%-os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen szűrjük. 15 mg (37%) amorf, fagyasztva szárított, 9,42 % klórtartalmú (X) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. [«]§ = - 46,7° (c = 0,74, 59%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Val: 1,0; Phe: 1,0; Arg: 0,95. 11. példa Na -6-amino-hexanoil-Phe-Val-Arg-pNA -2 HCl (XI) a) lépés: Cbo-6-amino-hexanoil-Phe-Val-Arg(N02 )--pNA (Xla) Kiindulási anyagként 360 mg (0,5 mmól) (Ic) képletű vegyületet és 290 mg (0,75 mmól) Cbo-6-amino-kapronsav-p-nitro-fenil-észtert használunk fel. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 398 mg (95,5%) amorf (Xla) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. [a]f,5 =—5,7° (c = l,l. dimetilformamidban). b) lépés: N*-6-amino-hexanoil-Phe-Val-Arg-pNA • 2 HCl (XI) Kiindulási anyagként 300 mg (0,351 mmól) (Xla) képletű vegyületet használunk fel. A reakciót az 1. példa g) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket 33%-os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen szűrjük. Az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 127 mg (48%) amorf, 9,69% klórtartalmú (XI) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. [a]% = -32,0° (c =0,72, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Val: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 1,0. 12. példa H-Phe-Leu-Arg-pNA • 2 HCl (XII) a) lépés: Cbo-Leu-ArgíNO^-pNA (Xlla) Kiindulási anyagként 5 g (10,6 mmól) (la) képletű vegyületet és 4,92 g (12,7 mmól) Cbo-Leu-OpNP-t használunk. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH-20 gélen szűrjük. 6,1 g (98%) amorf (Xlla) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkroma-7
