170669. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típusú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására

170669 13 14 11. példa N-Bz-Ile-Ile-Arg-pNA. HCl (XI) a) lépés: Cbo-Ile-Ile-Arg(N02)-pNA (Xla) Kiindulási anyagként 800 mg (1,37 mmól) (IXa) képletű vegyületet és 640 mg (1,66 mmól) Cbo-Ile-OpNP-t használunk. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket Sephadex LH—20 gélen metanolban szűrjük. 838 mg (87,5%) részben kristályos (Xla) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatogránásan (futtatószer: Pj elegy) egységes. [oc]p = — 5,7° (c = 1,04, dimetilformamidban). b) lépés: N-Bz-Ile-Ile-Arg(N02)-pNA (Xlb) Kiindulási anyagként 440 mg (0,63 mmól) (Xla) képletű vegyületet és 171 mg (0,76 mmól) Bz20-t használunk. A reakciót a 2. példa a) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 409 mg (97%) részben kristályos (Xlb) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásán (futtatószer: Pj elegy) egységes. c) lépés: N-Bz-Ile-Ile-Arg-pNA.HCl (XI) Kiindulási anyagként 201 mg (0,3 mmól) (Xlb) képletű vegyületet használunk. A reakciót az 1. példában leírt módon végezzük. A nyers terméket 33%-os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen szűrjük. Az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 172 mg (87%) amorf, 5,33% klórtartalmú (XI) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. [a]g> = -57,0° (c = 0,67, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: lie: 2,0; Arg: 0,9. 12. példa N-Bz-Leu-Ile-Arg-pNA. HCl (XII) a) lépés: Cbo-Leu-Ile-Arg(N02

)-pNA (Xlla) Kiindulási anyagként 800 mg (1,37 mmól) (IXa) képletű vegyületet és 640 mg (1,66 mmól) Cbo-Leu-OpN-használunk. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 772 mg (81%) amorf (Xlla) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatogránásan (futtatószer: Pj elegy) egységes, [a]" = = - 7,3° (c = 1,02, dimetilformamidban). b) lépés: N-Bz-Leu-Ile-Arg(N02)-pNA (Xllb) Kiindulási anyagként-500 mg (0,72 mmól) (Xlla) képletű vegyületet és 205 mg (0,86 mmól) Bz2

0-t használunk. A reakciót a 2. példa a) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH— 20 gélen szűrjük. 482 mg (82%) amorf (Xllb) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj elegy) egységes, [a]^ = + 0,5° (c = 1,03, dimetilformamidban). c) lépés: N-Bz-Leu-Ile-Arg-pNA.HCl (XII) Kiindulási anyagként 193 mg (0,288 mmól) (Xllb) képletű vegyületet használunk. A reakciót az 1. példában leírt módon végezzük. A nyers terméket 33%-os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen szűrjük. A szűrletet fagyasztva szárítjuk. 166 mg (86%) amorf, 5,34% klórtartalmú (XII) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. [a]g = -51,4° (c =0,67, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Leu: 1,0; lie: 1,2; 5 Arg: 0,9. 13. példa 10 N-Bz-Ile-Leu-Arg-pNA.HCl (XIII) a) lépés: Cbo-Ile-Leu-Arg(N02

)-pNA (XlIIa) Kiindulási anyagként 880 mg (1,6 mmól) (lb) képletű vegyületet és 696 mg (1,8 mmól) Cbo-Ile-OpNP-t 15 használunk. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 750 mg (71%) amorf (XlIIa) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: P, elegy) egységes. 20 [ocg= -9,85° (c = l,05, dimetilformamidban). b) lépés: N-Bz-Ile-Leu-Arg(N02)-pNA (XlIIb) Kiindulási anyagként 498 mg (0,71 mmól) (XlIIa) képletű vegyületet és 193 mg (0,85 mmól) Bz2

0-t használunk. A reakciót a 2. példa a) lépésében leírt módon 25 végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 345 mg (73%) részben kristályos (XlIIb) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj elegy) egységes, [ag = - 5,7° (c = 1,04, dimetilformamidban). 30 c) lépés: N-Bz-Ile-Leu-Arg-pNa.HCl (XIII) Kiindulási anyagként 170 mg (0,254 mmól) (XlIIb) képletű vegyületet használunk. A reakciót az 1. példában leírt módon végezzük. A nyers terméket 33%-os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen szűrjük. Az eluátu-35 mot fagyasztva szárítjuk. 129 mg (77%) amorf, 5,31% klórtartalmú (XIII) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. [oc]g= -49,9° (c=0,68, 50%-os ecetsavban). 40 Aminosav-elemzés eredménye: Leu: 1,0; lie: 1,1; Arg: 1,05. 14. példa 45 N-Bz-Leu-Leu-Arg-2-Na.HCl (XIV) a) lépés: Cbo-Arg(N02)-2-NA (XlVa) Kiindulási anyagként 3,6 g (10 mmól) vízmentes 50 Cbo-Arg(N02

)-OH-t használunk, amelyet 200 ml tetrahidrofuránban oldunk. Az oldathoz 1,0 g (10 mmól) Et3

N-t adunk, majd az oldatot a nedvesség kizárásával -10 C°-ra hűtjük. A hideg oldathoz 10 perc alatt 1,3 g (10 mmól) klór-55 hangyasav-izobutilészter 10 ml tetrahidrofuránnal készített oldatát adjuk, majd az elegyhez 10 perc elteltével 1,72 g (10 mmól) 2-naftilamint adunk. A reakcióelegyet szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni, és 24 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. A reakcióelegyet vákuum-60 ban szárazra pároljuk, a maradékot 3—5-szőr desztillált vízzel, 3—5-ször 5%-os vizes nátriumhidrogénkarbonátoldattal és ismét 3—5-ször desztillált vízzel mossuk, végül vákuumban szárítjuk. A nyers terméket metanolos oldatban Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 4,05 g (84%) 65 részben kristályos (XlVa) képletű vegyületet kapunk, 7