170669. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típusú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására
7 170669 8 A kivált Et 3N. HBr-t kiszűrjük, és a szűrletet —10 °C-ra hűtjük. A szűrlethez 4,3 g (12,7 mmol) Cbo-Leu-OpNP-t adunk, és az oldatot szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni. 3 óra elteltével az oldatot ismét —10 °C-ra hűtjük és 0,55 g (5 mmol) Et3N-nal pufferoljuk. Ezt a műveletet 2—3 óra elteltével megismételjük. Összesen 24 órás reakcióidő eltelte után az oldatot vákuumban 40 °C-on szárazra pároljuk. A maradékot 3 X 100 ml desztillált vízzel mossuk, majd vákuumban szárítjuk. A száraz nyers terméket metanolban oldjuk, és metanollal egyensúlyba hozott Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 6,1 g (98%) amorf (Ib) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: P, elegy) egységes. [a]o = — 33,3° (c = 1,0, metanolban). c) lépés: Cbo-Leu-Leu-Arg(N02)-pNA (Ic) Kiindulási anyagként 2,8 g (4,77 mmól) (Ib) képletű vegyületet és 2,22 g (5,72 mmól) Cbo-Leu-OpNP-t használunk. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 2,5 g (80%) amorf (Ic) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: P1 elegy) egységes. [<X]D = —9,9° (c = 1,0, dimetilformamidban). d) lépés: H-Leu-Leu-Arg-pNA.2HCl (I) Sakakibara-készülék [Bull. Chem. Soc. Japan 40, 2164 (1967)] reakcióterébe 134,2 mg (0,192 mmól) (Ic) képletű vegyületet helyezünk, és a reakciótérbe 5 ml vízmentes hidrogénfluoridot desztillálunk. Az elegyet 1 órán át keverjük. Ekkor az arginin-egység guanidinocsoportján levő nitro-védőcsoport és a Cbo-csoport lehasad. A hidrogénfluoridot vákuumban lepároljuk, és a száraz maradékot dimetilformamidban oldjuk. A peptid hidrogénfluoridját tartalmazó dimetilformamidos oldathoz 0,25 ml tömény sósavoldatot adunk, és az elegyet vákuumban szárazra pároljuk. Ezt a műveletet megismételjük. A maradékot 50%-os ecetsavban oldjuk, és 50%-os ecetsavval egyensúlyba hozott Sephadex G—25 gélen szűrjük. A tiszta tripeptid-hidroklorid-származékot tartalmazó eluátumfrakciót fagyasztva szárítjuk. 80,0 mg (71%) amorf, 11,83% klórtartalmú (I) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. [a]£= -29,9° (c=0,59, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Leu: 2,0; Arg: 0,95. 2. példa N-Bz-Leu-Leu-Arg-pNA.HCl (II) a) lépés: N-Bz-Leu-Leu-Arg(N02)-pNA (IIa) Az a) lépésben kiindulási anyagként 703 mg (1 mmól) (Ic) képletű vegyületet és 272 mg (1,2 mmól) Bz2 0-t használunk. Az (Ic) képletű vegyület benziloxikarbonil-csoportját az 1. példa b) lépésében leírt módon hasítjuk le. A kivált szilárd H-Leu-Leu-Arg(N02 )-pNA.HBr-t kiszűrjük. A szűrletet —10 °C-ra hűtjük, és 272 mg (1,2 mmól) Bz2 0-t adunk hozzá. Az elegyet 3 óra alatt szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni, majd ismét lehűtjük, és 0,07 ml (0,5 mmól) Et3 N-nal pufferoljuk. Ezt a műveletet 3 óra elteltével megismételjük. Összesen 24 órás reakcióidő után az oldatot vákuumban szárazra pároljuk, és a maradékot az 1. példa b) lépésében leírt módon feldolgozzuk. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 550 mg (82%) amorf (Ha) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj elegy) egységes. MD = —3,6° 5 (c = 1,01, dimetilformamidban). b) lépés: N-Bz-Leu-Leu-Arg-pNA.HCl (II) Kiindulási anyagként 554,8 mg (0,828 mmól) (Ha) képletű vegyületet használunk. A reakciót az 1. példa d) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket 10 20%-os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen szűrjük, majd metanolban, Sephadex LH—20 gélen ismét szűrjük. A szűrletet fagyasztva szárítjuk. 476 mg (87%) amorf, 5,30% klórtartalmú (II) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: 15 A elegy) egységes. [oc]-» = -73,0° (c=0,66, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Leu: 2,0; Arg: 0,95. 20 3. példa H-ß-ciklohexil-Ala-Val-Arg-pNA. 2HC1 (III) a) lépés: Cbo-Val-ArgíNO^-pNA (Illa) Kiindulási anyagként 20,6 g (43,5 mmól) (la) képletű 25 vegyületet és 20,3 g (54,3 mmól) Cbo-Val-OpNP-t használunk. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolból átkristályosítjuk. Az anyalúgot metanollal egyensúlyba hozott Sephadex LH—20 gélen szűrjük. Összesen 23,2 g 30 (93,3%) (Illa) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: P1; illetve C elegy) egységes. Op.: 200—202 °C, [a]£= +5,8° (c = 1,0, dimetilformamidban). 35 b) lépés: Cbo-ß-ciklohexil-Ala-Val-Arg(NÖ2)-pNA (Hlb) Kiindulási anyagként 0,48 g (0,83 mmól) (Illa) képletű vegyületet és 0,53 g (1,24 mmól) Cbo-ß-ciklohexil-Ala-OpNP-t (op.: 105—106 °C, [«]£ = -28,8° (c = 40 1,0, dimetilformamidban)] használunk. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 531 mg (88%) amorf (Illb) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj 45 elegy) egységes, [a]^ 3 = — 7,3° (c = 2,0, dimetilformamidban). c) lépés: H-ß-ciklohexil-Ala-Val-Arg-pNA• 2HC1 (III) Kiindulási anyagként 120,4 mg (0,165 mmól) (Illb) képletű vegyületet használunk fel. A reakciót az 1. példa 50 d) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket 20%-os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen szűrjük. Az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 56,6 mg (55%) amorf, 11,32% klórtartalmú (III) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A 55 elegy) egységes, [a]f>3 = - 36,8° (c = 0,62, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Val: 1,0; ß-ciklohexil-Ala: 1,1; Arg: 1,0. 60 4. példa N-Bz-ß-ciklohexil-Ala-Val-Arg-pNA • HCl (IV) a) lépés: N-Bz-ß-ciklohexil-Ala-Val-Arg(NÖ2)-pNA 65 (IVa) 4
