170665. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminocukor származékok tiszta állapotban való elkülönítésére keverékeikből
19 170665 20 a-Amiláz-gátlás Szacharáz-gátlás nl+ n 2 AIE/g SIE/g 4 67 000 000 7000 5 57 000 000 3500 6 42 000 000 1200 7 24 000 000 60 8 5 000 000 10 A találmányt közelebbről az alábbi kiviteli példákkal kívánjuk megvilágítani. A példákban a hexózegységek glükózegységeket jelentenek. Megjegyezzük, hogy a végtermékek azonosítási adatait korábban már ismertettük. 1. példa Néhány példában kiindulási anyagként olyan termékkeveréket használunk fel, amelyet az alábbi módon állítottunk elő. 8 liter, 5,0% keményítőt, 1,0% élesztőextraktumot, 0,2% K2 HP0 4 -et tartalmazó táptalajt üvegfermentorba viszünk, beoltjuk az SE 50/13 (CBS 614.71) törzs 3 napos rázott tenyészetével és intenzív keverés és levegőztetés közben 3 napon át tenyésztjük 28 °C-on; így 105 000 AIE/ml aktivitású tenyészfolyadékot kapunk. 6 liter ilyen fermentációs folyadék pH-ját 20 °C-ra való lehűlés után kétszeres hígítású tömény salétromsavval 2,5-re állítjuk be, összekeverjük 30 g Carboraffin aktív szénnel és 10 percen át keverjük. Ezután 15 percen át centrifugáljuk percenként 10 000 fordulattal, és a tiszta, halványsárga felső réteget ammóniával végzett semlegesítés után 500 ml térfogatra bepároljuk. Az 500 ml térfogatú koncentrátumot 45 percen át keverjük 200 g Amberlite IRA 410 Cl- ioncserélővel, szűrjük és összekeverjük 400 ml metanollal, hogy a nagymolekulájú keményítő-lebontási termékek főtömegét (a még jelenlevő aktív szén maradékkal együtt) lecsapjuk. 5 percen át centrifugáljuk 5000 fordulat/perc sebességgel. A 850 ml térfogatú felső réteget intenzív keverés közben becsepegtetjük 4 liter száraz alkoholba. A fehér, pelyhes csapadékot leszűrjük, háromszor mossuk, száraz alkohollal és kétszer éterrel és vákuumban 50 c C-on szárítjuk. Kitermelés: 36 g fehérszínű por, amelynek aktivitása 10 X106 AIE/g. 2. példa A fermentációk végterméke összetételének a meghatározására vékonyrétegkromatográfiás meghatározást végzünk; ekkor a fermentációs folyadék 1 [xl-ét vagy a készítmény 1 [i,g-ját kész Kieselgel lemezre visszük fel (gyártja Schleicher und Schüll, Dassel, F 1500 típusú) és kétszer kifejlesztjük n-butanol-etanol-víz 50: 30: 20 elegyben. A szacharáz inhibitor elszíneződéssel történő meghatározása céljából a kifejlesztett és jól megszárított lemezt bepermetezzük enzimgéllel (20 ml/20 X 20 cm méretű lemez), és a gélt hagyjuk megdermedni. Ezután 5 percen át előinkubáljuk szobahőmérsékleten, nedves kamrában és azt követően szubsztrát-géllel permetezzük be. Ennek a második gélrétegnek a megdermedése után 5 a lemezt nedves kamrában 40 °C-on inkubáljuk. Az inhibitor által okozott elszíneződés (világos foltok, vöröses barna háttér) 60—90 perc alatt fejlődik ki. Az optimális színkifejlődés időpontjában az inkubálást megszakítjuk és a lemezt az azon levő agar-rétegekkel együtt meleg 10 levegővel megszárítjuk. A gélek elkészítése Enzimgél: 1,5 g agarózt (L'Industrie Biologique Francais) 100 ml 0,2 m 6,0 pH-értékű nátrium-maleinátpuf-15 ferben szuszpendálunk, majd ezt követő felforralással feloldjuk. A tiszta agaróz-oldatot 50 °C-ra hűtjük és rázás közben összekeverjük 250 [ú Triton X—100 oldattal (2 g Triton X—100 + 8 g p. a. etanol) és 0,5 ml dianizidin-oldattal (20 mg dianizidin/1 ml aceton). Köz-20 vétlenül a gél felhasználása előtt hozzáadunk 1 ml GOD/POD-reagenst (12,5 mg I. tisztasági fokú glükózoxidáz, gyártja a Boehringer cég, megrendelési szám 15 423 és 2,5 mg II. tisztasági fokú peroxidáz, gyártja a Boehringer cég, megrendelési szám 15 302, 5 ml malei-25 nát-pufferben oldva) és 4—5 egység disznóvékonybélből származó szacharázt (ezt az enzimkészítményt a szacharáz-próbában a fentiekben már ismertettük). A gélt a kipermetezésig 50 °C-on kell tartani, különben már a kipermetezéskor beledermed a fúvókába. 30 Szubsztrát-gél: 0,5 g agarózt 100 ml nátriummaleinát-pufferben (pH = 6,0) szuszpendálunk és forralás közben feloldjuk. Ezután 50 °C-ra hűtjük, összekeverjük 100 [i.1 Triton-nal (2 g Triton X—100 + 8 g p. a. etanol) és 35 hozzáadunk 1 g szacharózt (Serva Nr. 35 579). A szacharóz feloldódása után a gél felhasználható. Az amiláz inhibitor elszíneződéssel történő meghatározása céljából a kifejlesztett és megszárított vékony-40 rétegkromatográfiás lemezt amiláz-géllel bepermetezzük (20 ml/20 X 20 cm méretű lemez), és hagyjuk megdermedni. A lemezt 5 percen át előinkubáljuk szobahőmérsékleten, majd a gélréteget tartalmazó lemezt 0,5%-os keményítő-oldatba merítjük (1 g keményítő, Merck 45 Nr 1252, 200 ml 0,2 m glicerinfoszfát-pufferben, 0,01 m CaCl2 , pH = 6,9, forralással feloldva) és 2 percen keresztül benne hagyjuk 40 °C-on, az oldatot tartalmazó edényt eközben lezárt állapotban megforgatjuk. Ezután a lemezt desztillált vízzel jól leöblítjük, és a be nem 50 épült keményítő elszínezése céljából híg jód-oldatba merítjük (4 ml jód-törzsoldat 500 ml vízzel hígítva; jódtörzsoldat: 2,2 g J2 +4,4 g KJ 100 ml vízben oldva). Az elszíneződés körülbelül 1 perc múlva optimális. Azonnal lefényképezzük, mert a kék foltok gyorsan el-55 halványulnak. Amiláz-gél elkészítése 1 g agarózt 100 °C-on feloldunk 100 ml 0,2 m nátrium-glicerinfoszfát/0,01 m CaCl2 -pefferben (pH = 6,9), 60 50 °C-ra való hűtés után hozzáadunk 100 JJ.1 Triton X— 100-at (2 g Triton X—100 + 8 g p. a. etanol). Közvetlenül a permetezés előtt hozzáadunk 100 jxl amilázkristályszuszpenziót (10 mg sertés-pankreász-amiláz) ml telített ammóniumszulfát-oldat, Boehringer, Nr 65 15 017). 10
