170665. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminocukor származékok tiszta állapotban való elkülönítésére keverékeikből
170665 27 28 11. példa 200 g 1. példa szerinti termékkeveréket 940 ml desztillált vízben és 60 ml koncentrált kénsavban feloldunk, és 4 órán át melegítjük visszafolyató hűtő alkalmazása- 5 val (belső hőmérséklet: 98—100 °C; olajfürdő hőmérséklete: 140 °C). A lehűtött, feketésbarna oldatot összekeverjük 10 g aktív szénnel (Merck Art. 2186), és 1 órán át keverjük. Ezután az aktív szenet leszűrjük, vízzel mossuk és a szűrlet pH-ját körülbelül 250 ml 10 n ká- 10 liumhidroxid-oldat hozzáadásával 7—8-ra beállítjuk. Az oldatot 1 órán át keverjük 50 g aktív szénnel. A szenet leszűrjük, 2 liter vízzel mossuk, és a szűrletet eldobjuk. Deszorpció céljából a szenet éjszakán át digeráljuk 2 liter 30%-os alkohollal. Végül a szenet leszűrjük és az 15 alkoholos oldatot rotációs bepárlóban bepároljuk. Maradék: 6,2 g. Ezt a nyers terméket (6,2 g) 500 ml vízben oldjuk, és egy órán át óvatosan keverjük 30 g Amberlite IR 120 (H+-alak) gyantával. Ezután a gyantát leszűrjük és desztillált vízzel addig mossuk, amíg a szűrlet sem- 20 leges és glükózmentes nem lesz. Ezután az ioncserélőt éjszakán át keverjük 1000 ml vízben 15 ml 25%-os ammóniával, majd elválasztjuk és eldobjuk. A szűrletet rotációs bepárlóban bepároljuk. Maradék: 3,7 g. További tisztítás céljából a terméket cellulózon kro- 25 matografáljuk. Az ioncserélőről deszorbeált anyag 4,5 g-ját cellulózzal töltött, 1 m hosszú és 2,5 cm széles oszlopra visszük fel. A futtatáshoz először etanol—víz 5 : 1 elegyet használunk, az olyan aminocukor-származék eluálásához, amelyben nj+n2 = l, etanol—víz 30 3 : 1 elegyet. Percenként 20 csepp csepegési sebesség mellett 14 ml-es frakciókat veszünk el. Az egyes frakciókat vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk. A 47— 85. frakciók bepárlás után 1,6 g 99,5%-os tisztaságú gyengén barnás színű olyan aminocukor-származékot 35 szolgáltattak, amelyben nt + n2 = 1. A színező szennyezések mennyiségileg nem játszanak szerepet. Színtelen aminocukor-származékot (nx -+- n2 = 1) akkor kapunk, ha az erősen savas ioncserélővel végzett tisztítási műveletet nem a reakcióelegyben, hanem oszlopon végezzük. 40 12. példa 200 g, 1. példa szerinti termékkeveréket feloldunk 45 940 ml desztillált vízben és 60 ml koncentrált kénsavban, és 1/4 órán át melegítjük visszafolyató hűtő alkalmazásával (belső hőmérséklet: 98—100 °C; olajfürdő hőmérséklete: 140 °C). A lehűtött, feketésbarna színű oldatot összekeverjük 10 g aktív szénnel (Merck, Art. 50 2186), és 1 órán át keverjük. Ezután az aktív szenet leszűrjük, vízzel mossuk, és a szűrlet pH-ját körülbelül 250 ml 10 n káliumhidroxid-oldattal 7—8-ra beállítjuk. Az oldatot 1 órán át keverjük 50 g aktív szénnel. A szenet leszűrjük, 1 liter vízzel mossuk, és a szűrletet eldob- 55 juk. Deszorpció céljából a szenet éjszakán át digeráljuk 2 liter 30%-os alkohollal. Végül a szenet leszűrjük, és az alkoholos oldatot rotációs bepárlóban bepároljuk. Maradék: 8,0 g. A maradékot 15 ml vízben felvesszük, és 50 g Amber- 60 lite ÍR 120 (H+-alak) ioncserélővel töltött oszlopra (magassága: 20 cm, átmérője 2,4 cm) visszük fel. Átfolyási sebesség: 3 csepp/perc, majd vízzel utánamossuk (12 csepp/perc), amíg az összes nem bázisos alkotórészt el nem távolitottuk. Ezután a bázisos termékeket 0,5%-os 65 ammóniával eluáljuk az oszlopról, és a vizes oldatot rotációs bepárlóban szárazra pároljuk. Maradék: 4,1 g. Ennek a maradéknak 2 g-ját kevés vízben feloldjuk, és Sephadex G—15 ioncserélővel töltött oszlopra (magassága: 200 cm; átmérője: 3,0 cm) visszük fel. Vízzel eluáljuk. 8 ml/óra átfolyási sebesség mellett 2—2 ml térfogatú frakciókat veszünk el. Az egyes frakciókat vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk. A 85—94. frakciók 280 mg olyan aminocukor-származékot szolgáltatnak, amelyben nx + n 2 = 2, specifikus aktivitást 50 000 SIE/g. 13. példa Az 1. példa szerinti termékkeverék 2 g-ját 60 ml 20 mM nátrium-glicerinfoszfát-pufferben (pH = 6,9, 1 mM CaCl2 ) inkubáljuk 1 g Aspergillus spec.-ből nyert oc-amilázzal (Serva Nr. 13 418) állandó keverés közben 120 órán át, 37 °C-on, majd 5 percen át 120 °C-on melegítjük, az oldhatatlan maradékot 4000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással eltávolítjuk; így az oldat liofilizálása után 1,9 g terméket kapunk, amelynek aktivitása 3500 SIE/g és 2 X 106 AIE/g. Ezt a terméket vékonyrétegkromatográfiásan és szacharáz próbával vizsgáljuk a 2. példa szerinti módon. Az eredmények azt mutatják, hogy gátló hatású vegyületekként 90% menynyiségben olyan aminocukor-származékok vannak jelen, amelyekben nx +n 2 = 1, 2 és 3. A homológok egymásközti aránya közel egyenlő. 14. példa Az 1. példa szerinti termékkeverék 2 g-ját 30 ml 20 mM acetát-pufferben (amelynek pH-értéke 4,8) inkubáljuk 1,25 mg édesburgonyából nyert ß-amilazzal (Boehringer 15 471) állandó keverés közben, 120 órán át 37 °C-on, majd 5 percen keresztül 100 °C-on melegítjük és az oldhatatlan maradékot 4000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással eltávolítjuk. így az oldat liofilizálása után 1,5 g terméket kapunk, amelynek aktivitása 1800 SIE/g és 3,8 X 106 AIE/g. Ezt a terméket vékonyrétegkromatográfiásan és szacharáz próbával vizsgáljuk a 2. példa szerinti módon. így azt az eredményt kapjuk, hogy gátló hatású vegyületekként 90% mennyiségben olyan aminocukor-származékok vannak jelen, amelyekben n1 +n 2 =2 és 3, és a két homológ egymásközötti aránya közel egyenlő. 15. példa 200 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 25 ml táptalajt, amelynek összetétele 0,1% K2 HP0 4 , 0,2% (NH 4 ) 2 S0 4 , 0,05% MgS04 , 0,05% KCl, 0,01% FeS04 és 2% 1. példa szerinti készítmény, beoltunk az Aspergillus niger ATCC 11 394 jelzésű törzs spóraszuszpenziójával, és 28 °C-on tenyésztjük rázógépen, így a 210 000 AIE/ml AIE-Titer 6 nap múlva 53 000 AIR/ml-re és 10 nap múlva 21 300 AIE/ml-re csökkent. Egyidejűleg az SIE/ml tartalom 7,0-ról 72 SIE/ml-re növekszik. A spóraszuszpenzióval végzett inkubálást 10 napon át folytatjuk, ekkor az oldat 20 ml-ét a micélium eltávolítása céljából 30 percen át centrifugáljuk 3000 fordulat/perc sebességgel. A 15 ml térfogatú felső réteget 14
