170622. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szinergetikus hatású vírusellenes készítmény előállítására

9 170622 10 Szövetkultúra táptalajok: Parker -199-es médium 5-10% borjúsavóval, illetve savőpótlóval kiegészítve, és 1%-os nátriumhidrogénkarbonát/szénsav pufferrel pH 7,2-7,4-re beállítva. A humán foetális szövetkultúrát úgy készítjük, 5 hogy friss humán foetusokból tripszines emésztéssel nyert, többszörösen mosott sejtekből 106

/ml sejtszámmal stacioner szövetkultúrát indítunk a fent leírt táptalajban és 4-5 napi 37 C -on történt tenyésztés után használjuk fel. 10 Challenge vírus és értékmérés: Vesicular stomatitis vírus (VSV) Indiana törzsét egér L-929 fibroblaszt sejteken szaporítjuk. Az értékmérést primer csirkeembrió fibroblaszt monolayereken képzett plaque-ok számlálása alapján végezzük. L sejtekben 103 p.f.u. 15 (plaque formáló egység), humán foetus sejtkultúrákban 105 p.f.u./ml-t alkalmazunk. "~ Szövetkultúrában mért biológiai aktivitás alatt azt értjük, hogy az aktivátort még éppen nem toxikus 20 koncentrációban alkalmazva hány Mg poli I : C szükséges az alkalmazott szövetkultúra sejtjeinek teljes megvédéséhez VSV-vírussal széniben. Toxikus "koncentráció alatt azt az aktivátor koncentrációt értjük, amelyek jelenlétében a sejtek már mikroszkopikusan 25 észlelhető morfológiai elváltozást szenvednek. A polikationok biológiai aktivitását tehát az említett viszonyok között mért poli I : C minimális aktív dózisával fejezzük ki mikrögramm/ml-ben. 30 Az induktor minimális aktív dózisának meghatározása: a szövetkultúra táptalajba bemérjük a kérdéses polikation még éppen nem toxikus dózisát és ezzel mint hígító folyadékkal hígítjuk az induktor (például poli I : C) törzsoldatot. Az elegy l-l ml-ét rámérjük 35 a szövetkultúra sejtjeire, 12 órán át 37C°-on inkubáljunk, mossuk, majd új tápfolyadék 1 ml-ében bevisszük a challenge vírust és mikroszkóppal értékelünk 48-72 órás, 37 C°-on végzett inkubálás után. Kérdéses esetben csirkeembrió fibroblaszt 40 monolayeren plaque titrálást végzünk. c In vivo viszgálatok 20-22 g-os CFLP albino egereken. Az induktor és aktivátor oldatot sterilre szűrve, steril pufferrel adagoljuk és minden oltásnál 2000 NE/egér penicillin G-t adunk a bakteriális 45 fertőzések elkerülésére. A Hong Kong 68/1 influenza vírustörzs tejlesen adaptálódott az egerek tüdejéhez, azaz 100—1000 vírus részecske elég az állat elpusztításához. A fertőzést tracheálisan, enyhe éteres érzéstelenítés mellett 50 végezzük. Az 5-5 egérből álló csoportokat 1-10000 LD50

vírus adaggal fertőzzük. Az IHD neurovirulens vakcinia vírus esetében a fertőzést egerenként 0,03 ml-ben levő 10-10000 LD50

vírus adaggal intracerebrálisan végezzük. A túlélési időt 55 mérjük és DJ. Bauer módszere [Brit. J. Exp. Path. 42, 201 (I960)] szerint átlagos reciprok túlélési időben fejezzük ki. A készítmények kiviteli alakja, lehet oldat, szuszpenzió, liofilizált vagy bepárolt szilárd anyag, 60 vagy szerves oldószerek, például alkohol felhasználásával előállított precipitátum. Az egyes komponensek abszolút és relatív mennyisége a készítményekben nagymértékben függ a kezelt organizmustól és az alkalmazás módjától. 65 A továbbiakban példaképpen ismertetünk néhány példát a találmány szerinti készítmények előállítására. 1 /a-i. készítmények 40 mg aktivátort oldunk 100_ml fiziológiás NaCl oldatban. Semlegesítés és steril szűrés után sterilen 100 ml steril fiziológiás NaCl oldatot keverünk hozzá, amely 1 //g/ml induktort tartalmaz. Az oldatot sterilen lOml-enként ampullákba töltjük és fagyott állapotban tároljuk. Ily módon állíthatók elő például az alábbi készítmények: l/a. A, (0,81, 88) - poli I: C (12,2, 6,3) I/b. A, (0,92, 94) - poli I: C (4,7, 3,1) I/c. Ai(l,13, 96) - poli I : C (4,7, 3,1) I/d.A^O.ÓO^-statolon I/e. A3( -, 91) - poli I : C (12,2, 6,3) l/f. A2(0,90, 93) - poli I : C (12,2, 6,3) l/g. A4( -, 92) - poli I: C (12,2, 6,3) l/h. A,(0,92, 94) - poli I : C (12,2, 6,3) I/i. Ai(l,13, 96) - poli I : C (12,2, 6,3) II/a-i, készítmények Az l/a-i. készítményeknél követett módszert alkalmazzuk, azzal a különbséggel, hogy az oldatok 10% dextránt tartalmaznak. III/a-i. készítmények Az l/a-i. készítményeknél követett módszert alkalmazzuk, azzal a különbséggel, hogy az oldatok 5% polivinilpirrolidont tartalmaznak. IV/a-i. készítmények Az l/a-i. készítményeknél követett módszert alkalmazzuk, azzal a különbséggel, hogy az oldatok NaCl helyett 0,1 M pH 7,2 értékű foszfát puffert tartalmaznak. V/a-i. készítmények Az l/a-i. készítményeknél követett módszert alkalmazzuk, azzal a különbséggel, hogy az oldatok NaCl helyett 0,2 mól pH 7,4 értékű citrát puffert tartalmaznak. VI/a-i. készítmények Az l/a-i. készítményeknél követett módszert alkalmazzuk, azzal a különbséggel, hogy az oldatokat ampullába töltjük és liofilizáljuk. VII/a-e. készítmények Az l/a-e. készítményeknél követett módszert alkalmazzuk, azzal a különbséggel, hogy az aktivátorok semleges sósavas sóját alkalmazzuk és az oldatok semlegesítését elhagyjuk. 5