170618. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a Marek-féle betegség elleni vakcína előállítására
5 170618 6 nyészetekből a vírussal fertőzött sejteket a fent említett tripszint és etiléndiamintetrae cetsav-dinátriumsót tartalmazó fiziológiás konyhasóoldattal nyertük ki, majd friss tenyészeteket fertőztünk velük. Az egymást követő átoltásokat mindaddig 5 végeztük, amíg elég vírust tartalmazó sejtet kaptunk. Rendszerint 4-7 passzázs szükséges ahhoz, hogy a kellő mennyiségű vírust előállítsuk. 1—1 termelés anyagát, amely 106 -3xl0 6 PFE/ml fertőző dózist tartalmaz, általában 1-2 x 107 sejt/ml 10 dózisban osztjuk szét. A sejthez kötött vakcinát dozírozás után azonnal hűtjük, és -70 vagy -196C°-on tároljuk felhasználásig. Eljárhatunk úgy is, hogy a fent beállított titerű, sejthez kötött vakcinát sejtmentessé tesszük és liofilizálás után 15 +4 C°-on tároljuk. A vakcinák sejtmentessé tehetők, ha a sejteket valamilyen módon szétroncsoljuk, a leggyorsabb eljárás az ultrahang kezelés. Az így sejtmentessé tett vakcinát vagy mélyhűtve tároljuk, vagy liofilizáljuk és +4 C°-on tároljuk. 20 A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal szemléltetjük. 25 1. példa 12 hetes egészséges pulyka 10 ml . térfogatú, alvadásban gátolt (0,2% EDTA-dinátriumsó fiziológiás konyhasó-oldatban, 1 ml/9 ml vér) perifériás 30 véréből ismételt mosással elkülönítjük a fehérvérsejteket és 4 órás KEF tenyészeteket fertőzünk meg az anyaggal. A tenyészeteket 37 C°-on 5% CO^ -t is tartalmazó nedves légtérben 24—48 órán keresztül inkubáljuk, majd az indító tápfolyadékot 35 fenntartó tápfolyadékra cseréljük. Az ily módon fertőzött szövettenyészeteket további 7—11 napon át inkubáljuk, amikorra rendszerint a jellegzetes sejtkárosító hatás megjelenik. A tápfolyadékot 2-3 naponként friss tápfolyadékra cseréljük át. 40 KEF indító tápfolyadék: Earles' táptalaj 75% laktalbumin hidrolizátum 10% élesztőkivonat 0,5% újszülött borjú savója 10% penicillin 1% streptomicin 1% kan amicin 1% Fungizon 1% A fenntartó tápfolyadékban a borjúsavó mennyi- 60 ségét 5%-ra csökkentjük. A 7—10. napra a gócokban jelentkező, vírussal fertőzött sejteket 0,1% tripszint és 0,02% EDTA—dinátriumsót tartalmazó fiziológiás só oldat segítségével a tenyésztő edény falától elválasztjuk és szuszpendáljuk. A sejteket 65 1000 g gyorsulással 10 percen át centrifugáljuk, majd a felülúszó réteg elöntése után a sejteket indító tápfolyadékban szuszpendáljuk, és friss, 4 órás KEF tenyészetekhez adjuk. Ezután ugyanúgy járunk el, amint azt a fentiekben leírtuk és az átoltásokat 4 passzázson keresztül ismételjük, majd a végső vakcinát 1,4 xlO7 sejt/ml dózisban szétosztjuk és lassú hűtéssel —196C°-on tároljuk. Ennek a terméknek a vírustitere 9,9 x 10 s plakkformáló egység/ml. 2. példa Az 1. példa szerinti módon előállított anyagok folyékony nitrogénben (-196 C°) tárolt ampulláiból l-l ampullát felolvasztunk és azok tízszeres hígításából 0,5 ml Petri-csésze dózissal 15—15 darab 48 órás, 10 napos SPF (specifikus kórokozótól mentes) csirkeembrióból készült CSEF tenyészetet oltunk. A Petri-csészéket ugyanolyan körülmények között inkubáljuk, mint az 1. példa esetében. A fertőzést követő 48. órában a specifikus sejtelváltozás megjelenését követően a fertőzött edények sejtjeit az 1. példa szerinti oldat segítségével elválasztjuk a tenyésztőedény falától. Az így kapott sejtszuszpenziót 1000 g gyorsulással 10 percen át centrifugáljuk, majd 10% dimetilszulfoxidot tartalmazó szaporító tápfolyadékban szuszpendáljuk és 7x1 ml-es mennyiségben szétosztva lassú hűtéssel —40C°-ig hűtjük, majd -196 C°-on tároljuk a következő passzázsig. Ekkor 5—5 ampullát kiemelünk a folyékony nitrogénből és a sejtes anyagot 32-32 db 48 órás SPF CSEF tenyészetre mérjük. 48 óra után a sejteket a fent leírt módon összegyűjtjük, majd 15—15 ml tároló folyadékban szétosztva 1 ml-es mennyiségben lehűtjük és -196C°-on tároljuk. A tároló folyadék összetétele: Earles' táptalaj 75% borjúsavó 15% dimetilszulfoxid 10% 3. példa Az 1RS izolátum patogenitásának meghatározására az 1. példában leírt módon előállított vakcina 98200 plakkformáló egység/0,1 ml dózisával oltunk intra-abdominálisan napos korú, genetikailag nagyon fogékony vörös izlandi (Vi) csirkéket. A megfertőzött és kontroll állatokat steril levegővel ellátott műanyag izolátorokban tartjuk. A megfertőzött állatok a 77 napos megfigyelési időszak végéig egészségesek maradtak. A vírus szervezetükben elszaporodott, amint azt a 19. és 77. napon végzett vírus visszaizolálás és a vérsavók pozitív reakciója igazolta. A kórszövettani vizsgálat eredménye szerint a perifériás idegrendszerben és néhány zsigeri szervben az MB-re utaló sejtes reakciót lehetett észlelni. A kísérlet menetét és eredményét az 1. táblázat mutatja. 3
