170539. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N4-acil-1-béta-D-arabinofuranozil-citozinok előállítására
170539 , 3 4 kenése mellett ecetsav-egységekre bomlanak le, míg egy magasabb, páratlan szénatomszámú zsírsav, amely a természetben nem fordul elő, az emberi szervezetben a fent leírttól eltérő módon mehet át béta-oxidáción. A természetes zsírsavakból származó N4 -acil-1 -béta-D-arabinofuranozil-citozinok ezért feltehetően másként viselkednek az emberi szervezetben, mint egy a természetben elő nem forduló zsírsavval előállított N4 -acil-l-béta-D-arabinofuranozil-citozinok, így fennáll az a lehetőség hogy tumorellenes aktivitásuk is eltérő lehet. További vizsgálataink eredményeként azt is felismertük, hogy a természetben elő nem forduló páratlan szénatomszámú 23—35 szénatomos zsírsavakkal előállított N4 -acil-l-béta-D-arabinofuranozilcitozinok ugyanakkora, vagy magasabb tumorgátló aktivitást mutatnak, mint az 1-béta-D-arabinofuranozil-citozin. Egyik ismert eljárás az N4 -acetil-l-béta-D-arabinofuranozil-citozin előállítására abban áll, hogy az 1 -béta-D-arabinofuranozil-citozint metanolban oldják és a reakció közben több alkalommal ecetsavanhidrid-felesleget adagolnak (I. Wempen és társai, lásd fent). Mivel ezen módszer szerint túl sok ecetsavanhidrid megy veszendőbe, ez az eljárás üzemileg nem kivitelezhető és ezt a találmány keretében nem alkalmazzuk. Azt találtuk, hogy a találmány szerinti vegyületek csaknem kvantitative állíthatók elő egy olyan eljárás segítségével, amely abban áll, hogy az 1-béta-D-arabinofuranozil-citozin és egy 23-35 szénatomos R fenti jelentésének megfelelő zsírsav anhidridje keverékét reagáltatjuk vegyes oldószerben (amely nagyfeleslegű vízből és valamely, alkoholtól különböző vízzel elegyedő szerves oldószerből áll). Annak érdekében, hogy jó kitermeléssel, szelektíven acilezzük csupán az arabinonukleozid amino-csoportját, bizonyos határok között kell tartanunk az arabinonukleozid, a zsírsavanhidrid és a víz arányát. Közelebbről: a zsírsavanhidrid legalább az arabinonukleoziddal ekvimolekuláris, előnyösen 2—3 mólfeleslegnek megfelelő mennyiségben kell, hogy jelen legyen az arabinonukleozidhez viszonyítva. A víz legalább ekvimolekuláris mennyiségben alkalmazandó a zsírsavanhidridhez viszonyítva, előnyösen nagy (például 20-100 mólekvivalensnyi) feleslegben. Ezenkívül vízzel elegyedő szerves oldószert, például dioxánt, acetonitrilt, acetont, tetrahidrofuránt, dimetilformamidot vagy dimetilszulfoxidot adagolunk, amíg a reakcióelegy homogén lesz. A szerves oldószer felhasznált mennyisége a zsírsavanhidrid szénatomszáma függvényében nő, de ha a szerves oldószert túl nagy mennyiségben adagoljuk, az arabinonukleozid kicsapódik. Ilyen esetben az arabinonukleozidot melegítéssel oldjuk. A zsírsavanhidrid az acil-csoport forrása. A savanhidridnek csak egyik acil-csoportja reagál az arabinonukleozid amino-csoportjával, amely N-acileződik, míg az anhidrid másik acil-csoportja szabad állapotban, karbonsavként marad vissza. A víz azt a célt szolgálja, hogy az arabinonukleozid arabinoíuranozil-csoportjában a hidroxil-gyök acilezését megakadályozza. Ha savanhidrid-felesleg van jelen az arabinonukleozid amino-csoportjának teljes acilezése után, a savanhidrid-felesleg reagál a jelenlevő vízzel és karbonsavvá alakul: ez a reakció kitün-5 tetett az arabinofuranozil-csoport hidroxil-csoportjának reakciójához képest. A művelet egyszerűsége szempontjából oldószerként különösen előnyben részesítjük a dioxánt 10 a reagáló rendszer homogénné tételére. A reakció hőmérséklete körülbelül 0C°-tól a használt oldószer forráspontjáig terjedhet, mimellett előnyben részesítjük a szobahőmérséklet (20-30 C°) és -80 C° közötti tartományt. Ha 80C°-nál alacso-15 nyabb forráspontú oldószert használunk, a reakció ezen a forrásponton visszafolyatás mellett végezhető. A reakcióhoz szükséges idő általában 24-48 óra szobahőmérsékleten és körülbelül 3-5 óra 70-80 C°-on. 20 Mivel az arabinonukleozid és az N-acilarabinonukleozid oldékonysága az oldószerben eltérő, a reakció végpontja úgy határozható meg, hogy a reakciótermék egy részét vékonyrétegkromatográfia 25 segítségével futtatjuk és UV-fénnyel (2537 Á) besugározzuk. A reakció befejeződése után a reakcióé legyet csökkentett nyomáson betöményítjük, és az oldószert ledesztilláljuk. A maradékhoz olyan oldószert adunk (például vizet), amelyben a termék 30 nehezen oldódik, a termék kicsapására. A csapadékot szűréssel összegyűjtjük és vízzel, ammóniával vagy benzollal stb. mossuk a nem reagált arabinonukleozid a nem reagált ecetsavanhidrid és a reakcióban keletkezett karbonsav vagy észter eltávo-35 lítására. Kívánt esetben nagymennyiségű apoláros oldószert, például n-hexánt, petrolétert, benzolt vagy dietilétert adagolunk a maradékhoz a reakcióelegy 40 csökkentett nyomáson való betöményítése után és a keveréket visszafolyató hűtő alatt melegíthetjük, hűthetjük és szűrhetjük a nem reagált ecetsavanhidrid és a reakcióban keletkezett karbonsav eltávolítására. Az így kapott nyers acilarabinonukleozidot 45 megfelelő szerves oldószerben — mint egy alkoholban, például forró etanolban - oldjuk, és kívánt esetben vizet adunk hozzá, majd az elegyet lehűtjük az N-acilarabinonukleozid kristályosítására. 50 A találmány szerinti eljárásban használható megfelelő zsírsavanhidridek például a következők lehetnek: egy telített vagy telítetlen monokarbonsav, például a triakozánsav, pentakózánsav, heptakozánsav, nonakozánsav, hentriakontánsav, ceroplasztin-55 sav stb. anhidridje, vagy telített vagy telítettlen dikarbonsavak anhidridjei. A reakcióterméket N4 -acil-l-béta-D-arabinofuranozil-citozinként azonosítjuk elemi analízis, UV ab-60 szorpciós spektrumelemzés és IR-abszorpciós spektrum-elemzés segítségével. Az elemi analízis értékei arra mutatnak, hogy az arabinonukleozidba 1 acil-csoportot vittünk be. Az UV abszorpciós spektrumban bekövetkezett jelen-65 tős változásból az látható, hogy az acil-csoport az 2
