170461. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízben oldható enzimek immobilizálására polivinilalkohol-gélbe zárás útján
5 170461 6 Egyes esetekben nagymértékű aktivitás-növekedés érhető el adalékanyagok, például polivinil-pirrolidon vagy inert fehérje, így szérumalbumin vagy zselatin adagolásával. Ezek az anyagok részben a fehérje-molekula védelmére szolgálnak, részben pe- 5 dig előnyösen módosítják a keletkezett film szerkezetét. A bezárt enzim mennyisége egyes esetekben jelentősen megnövelhető olyan módon, hogy a kapott immobilizált enzim-készítményt bifunkciós 10 reagenssel, előnyösen glutárdialdehiddel kezeljük. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők: 15 a) Teljesen általánosan alkalmazható, minthogy a gélek porozitását igen tág határok közöttt lehet változtatni, és így gyakorlatilag bármilyen molekulasúlyú enzim vagy más biopolimer bezárható. b) Olcsón és könnyen hozzáférhető anyagból 20 rendkívül egyszerűen kivitelezhető. c) Egyaránt alkalmas filmek, valamint különböző szemcsenagyságú granulátumok előállítására, ami a technológiai kívánalmakhoz való jó alkalmazkodást tesz lehetővé. 25 d) A bezárás folyamán az enzimet nem érik károsító kémiai hatások, és így az aktivitás-vesztés minimális. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 30 1. példa Aldoláz bezárása beszárítással készített 35 polivinilalkohol filmbe Taylor és munkatársai módszerével [J. Biol. Chem., 173, 591 (1948)] nyúl vázizom-aldolázt készítünk. A kapott kristályszuszpenziót lecentri- 40 fugáljuk, majd a kristályokat 7,5 pH-jú, 0,1 mólos Na2 HP0 4 -KH 2 P0 4 puffer-oldatban (a továbbiakban: foszfát-puffer) feloldjuk 1, 2, 3, 4 és 5 mg/ml koncentrációban, így a későbbiekben megadott arányok mellett az 1 cm2 duzzadt filmben levő enzim 45 mennyisége 1—10 nanogramm. E műveleteket + 5 C°-on végezzük. Kereskedelmi, kis acetát-tartalmú polivinilalkoholból vízfürdőn közelítőleg 2 órán át tartó mele- 50 gítésével 5 s% szárazanyag-tartalmú polivinilalkohol-oldatot készítünk, amelynek 5—5 ml-éhez 0,5 ml fentiek szerint előállított különböző koncentrációjú aldoláz-oldatot adunk. Alapos összekeverés és az esetleges levegőbuborékok eltávolítása után az al- 55 dolázt tartalmazó polivinilalkohol-oldatot egyenletes rétegben kiontjuk egy 25 cm2 felületű üveglapra, majd levegőáramban, szobahőmérsékleten az oldatot 4—5 órán át beszáradni hagyjuk. Teljes száradás után a filmet leválasztjuk az üveglapról, és foszfát- 60 -pufferral addig mossuk, amíg a mosófolyadékban enzim-aktivitás már nem mutatható ki. A szobahőmérsékletű pufferral végzett mosás közben az eredetileg 25 cm2 feleletű film 35-40 cm 2 -re duzzad. Az enzimaktivitásra számított kitermelés: 12%. 65 2. példa Aldoláz bezárása polivinil-pirrolidont tartalmazó polivinilalkohol filmbe beszárítással Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy a polivinilalkohol-oldatba 1% polivinil-pirrolidont adagolunk. Az aktivitásra számolt kitermelés 8%. A polivinil-pirrolidon adalékanyag megnöveli az oldhatatlan enzim-preparátum hőstabilitását. 3. példa Aldoláz bezárása polivinilalkohol filmbe beszárítással, szérumalbumin jelenlétében Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy az aldoláz-oldat készítéséhez felhasznált foszfát: púffer adalékként 100 mg/ml marha szérum-albumint tartalmaz. Az aktivitásra számolt kitermelés: 25%. 4. példa Aldoláz bezárása hordozóra felvitt polivinilalkohol filmbe beszárítással Az 1. példában leírt módon 5 s% szárazanyag-tartalmú polivinilalkohol-oldatot és 5 mg/ml koncentrációjú aldoláz-oldatot készítünk. 5 ml PVA-oldathoz 1 ml aldojáz-oldatot adunk, tökéletesen elkeverjük, majd az enzimet tartalmazó polimer oldatba szűrőpapírt vagy más, nedvesíthető hordozót mártunk be. Megvárjuk, míg a polimer-oldat beszívódik az anyagba, majd a hordozót kivesszük, és a felesleges polimer oldatot lecsurgatjuk. A hordozót légáramban szobahőmérsékleten súlyállandóságig szárítjuk, majd az 1. példában leírt módon kioldjuk az oldható enzimmennyiséget. Az enzimaktivitásra számolt kitermelés: 24%. 5. példa Aldoláz bezárása hordozóra felvitt polivinilalkohol filmbe, részleges szárítást követő tömény elektrolitos kezeléssel Mindenben a 4. példa szerinti módon járunk el, de a preparátumot csak addig hagyjuk megszáradni, amíg a benne levő vízmennyiségnek csak 50%-a távozik el, majd ezt a részlegesen megszárított preparátumot néhány órára +5 C°-os, 7,5 pH-jú, telített ammóniumszulfát-oldatba helyezzük. Az oldható enzimmennyiséget az 1. példában leírt módon eltávolítjuk. Aktivitásra számolt kitermelés: 24%. -3
