170437. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dez-Lys29-Ala30-inzulin- származékok előállítására
170437 8 3,28 pH-értéken, 55 percig 4,25 pH-értéken, és 155 percig 6,65 pH-értéken végezzük. Az inzulin 234 perc elteltével, a lizil-alanin 255 pej;c elteltével, míg a dez-Lys29-Ala 30 -sertés-inzulin 223 perc elteltével oldódik le. Csak két csúcsot észleltünk, amelyek a dez-Lys29 -Ala 30 -sertés-inzulinnak, illetve a lizil-alaninnak felelnek meg. Az elegy maradékát 0,1 mólos ammóniumkarbonát-óldattal egyensúlyba hozott porózus, keresztkötéses dextrángéllel (Sephadex G—50) töltött, 60 x 0,9 cm méretű oszlopra visszük fel. Az oszlopot 3 ml/óra sebességgel 0,1 mólos ammóniumkarbonát-oldattal eluáljuk, és 30 cseppes (1 ml) frakciókat gyűjtünk össze. A frakciók peptid-tartalmát a 280 nm hullámhosszon mutatott ultraibolya abszorpció mérésével meghatározzuk, és a főcsúcsnak megfelelő 25-35. frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Dez-Lys29 -Ala 3 °-sertés-inzulint kapunk. 2. példa Tízszer átkristályosított sertés-inzulint kalciumkloridot tartalmazó 0,1 mólos ammónium-hidrogénkarbonát-oldatban oldunk. Milliliterenként 2 mg inzulint tartalmazó oldatot készítünk, amelynek kalciumklorid-koncentrációja 3 • 10~4 mól. Az oldat részleteit 8,2 pH-értéken, 37 C°-on 40 órán át inkubáljuk. Az inkubálást AM-proteáz enzim jelenlétében végezzük, a következő enzim : szubsztrátum arányok betartásával: 1 : 625, 1 : 1250, 1 :2500 és 1 :5000. Az egyes reakcióelegyekből időről időre mintát veszünk, és a mintákat az 1. példában ismertetett módon elemezzük. A hasítás az első három esetben teljes mértékben végbemegy, míg az 1 : 5000 enzim : szubsztrátum arány fenntartásával végzett kísérletben 40 óra elteltével a hasítás csak 88%-ban zajlik le. 3. példa Tízszer átkristályosított sertés-inzulint ammóniából és ecetsavból készített, kalciumkloridot is tartalmazó, 4,0, 6,0, 8,0, illetve 10,0 pH-értékű pufferoldatban oldunk. Milliliterenként 2 mg inzulint tartalmazó oldatokat készítünk, amelyek kalciumklorid-koncentrációja 3 x 10~4 mól. Az egyes oldatmintákat AM-proteáz enzim jelenlétében (enzim : szubsztrátum arány = 1 : 100) 6 órán át 37 C°-on inkubáljuk. A 2. példában megadott elemzési módszerek szerint a hasítás minden esetben teljesen végbement. 4. példa Tízszer átkristályosított sertés-inzulint pH = 8,2 értékű 0,1 mólos ammónium-hidrogénkarbonát pufferoldatban oldunk. Milliliterenként 2 mg inzulint tartalmazó oldatot készítünk, amelynek kalciumklorid-koncentrációja 3 x 10"4 mól. Az oldat részleteit AM-proteáz enzim jelenlétében (enzim : szubsztrátum arány = 1 : 1000) 3 órán át 23C°-on, 37C°-on, 45 C°-on, illetve 55 C°-on inkubáljuk. A 2. példában megadott elemzési módszerek szerint a hasítás 37 C°-on és 45 C°-on teljesen végbement, 55 C°-on a hasítás mértéke körülbelül 50%, míg 23 C°-on a hasítás csak kis mérték-5 ben ment végbe. 5. példa !0 120 mg sertés-inzulin (egyszer átkristályosított, és Sephadex G-50 gélen, 0,1 mólos ammóniumkarbonát-oldattal végzett gélszűréssel tisztított termék) 14 ml vízzel készített, 8,0 pH-értékű, 3 x 10~4 mól kalciumkloridot tartalmazó oldatát 15 120 jug AM-proteáz jelenlétében 5 órán át 37C°-on inkubáljuk. Az inkubálás alatt az elegybe automatikus pH-szabályozó segítségével 0,005 mólos nátriumhidroxid-oldatot adagolunk, és így az elegy pH-ját 8,0 értéken tartjuk. A kapott oldatot poró-20 zus, keresztkötéses dextrángéllel (Sephadex G-50) töltött, 100x1,4 cm méretű oszlopra visszük fel, és az oszlopot 4 C°-on, 13 ml/óra sebességgel 0,1 mólos ammóniumkarbonát-oldattal eluáljuk. Az eluátumot 150 cseppenként (5 ml) frakciókba 25 gyűjtjük. A 280 nm hullámhosszon mutatott ultraibolya abszorpció mérésével meghatározzuk a frakciók peptid-tartalmát. A főcsúcsnak megfelelő 22-30. frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. 100 mg dez-Lys29 -Ala 30 -sertés-inzulint kapunk. Po-30 liakrilamid-gélen, 8,9 pH-értéken végzett elektroforézis során (előhívószer: amido-fekete) a termék egyetlen foltot ad. A termék sertés-inzulinhoz viszonyított, anódirányú mozgékonysága 1,2. A termék teljes aminosav-elemzése az 1. példában kö-35 zölttel azonos eredményt ad. 6. példa 40 1 mg sertés-inzulin 1 ml 0,1 mólos ammónium-hidrogénkarbonát pufferoldattal (pH = 8,2) készített oldatát 3 ml 4%-os agaróz-szemcsével töltött, és a fenti ammónium-hidrogénkarbonát pufferoldattal 22 C°-on egyensúlyba hozott, 10x0,5 cm 45 méretű oszlop tetejére visszük fel. Az agaróz-szemcsékhez kovalens kötéssel 5 mg AM-proteáz kapcsolódik. Az oszlopot 1 órán át 7 ml/óra sebességgel ammónium-hidrogénkarbonát pufferoldattal eluáljuk, majd 280 nm hullámhosszon mutatott 50 ultraibolya abszorpció alapján meghatározzuk az egyes frakciók peptid-tartalmát. A pepiidet tartalmazó frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Dez-Lys29-Ala 30 -sertés-inzulint kapunk, amelynek fizikai sajátságai megegyeznek az 5. példában közöl-55 tekkel. Az AM-proteázt hordozó agaróz-gélt a következőképpen állítjuk elő: 3 ml 4%-os agarózgél-szemcse (Sepharose 4B) 10 ml vízzel készített szuszpenziójához 450 mg 60 brómciánt adunk, és a szuszpenziót 20 percig keverjük. Eközben a keverék pH-ját 4 n nátriumhidroxid-oldat adagolásával 10 és 11 közötti értéken tartjuk. A szuszpenziót jéggel keverjük össze, majd 2 liter hideg, 8,0pH-értékű vizes pufferoldattal 65 mossuk (a pufferoldat 0,1 mól nátrium-hidrogén-4
