170437. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dez-Lys29-Ala30-inzulin- származékok előállítására
3 170437 4 -csoportot. Ezt a polipeptidet ennek megfelelően a továbbiakban dez-Lys -Ala 30-sertés-inzulinnak nevezzük. Az R1 helyén alanin-csoportot és R 2 helyén valin-csoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyület abban különbözik a marha-inzulintól, hogy a „B" peptidlánc nem tartalmazza a C-terminális lizil- és alanil-csoportot. Ezt a polipeptidet ennek megfelelően a továbbiakban dez-Lys29-Ala 30 -marha-inzulinnak nevezzük. A „főtömegében (I) általános képletű vegyületeket tartalmazó keverékek", valamint a „főtömegében sertés- vagy marha-inzulint tartalmazó keverékek" megjelölésen olyan anyagkeverékeket értünk, amelyek a megjelölt főkomponensek mellett csekély mennyiségben egyéb anyagokat (rendszerint szennyezőanyagokat) is tartalmaznak. Miként ismert, a kereskedelemben kapható sertés- és marha-inzulin - még a többször átkristályosított termék is— szennyezőanyagként egyéb polipeptideket is tartalmaz. A szennyezőanyagok mennyisége az összsúlyra számítva rendszerint 3-5%. A szennyezőanyagok az inzulintól nehezen elkülöníthető vegyületek, ezek közé tartozik például a pro-inzulin, a pro-inzulin-fragmensek és a glükagon. E szennyezőanyagok egy része az AM-proteáz-enzim, illetve a myxobacter AL—1 proteáz II enzim hatására kisebb molekulasúlyú polipeptidekre bomlik. Ennek megfelelően, ha a sertés- vagy marha-inzulint a fenti enzimekkel kezeljük, és a terméket elválasztjuk az enzimtől, a lizil-alanintól és az inzulinénál kisebb molekulasúlyú polipeptidektől (oligopeptidektől), a kiindulási anyagnál kisebb mértékben szennyezett végterméket kapunk. Feltételezhető, hogy az inzulin-készítményekben jelenlevő szennyezőanyagok elősegítik az antigén reakció kialakulását. Ezért ha az inzulin-készítményeket a fenti enzimek hatásának tesszük ki, a kiindulási anyag antigén sajátságait két úton - azaz a fó'komponens szerkezetének módosításával és a szennyezőanyagok mennyiségének csökkentésével — is visszaszoríthatjuk. A találmány szerinti eljárásban felhasználható AM-proteáz-enzim az 1 263 956 számú Nagy-britanniai szabadalmi leírásban ismertetett módon különíthető el az Armillaria melles gombafaj érett, termést hozó részeiből. Az enzimet az 1 263 956 számú Nagy-britanniai szabadalmi leírásban ismertetett eljárás módosításával egyszerűbben is elkülöníthetjük, úgy, hogy a (ív) kromatográfiás lépést két szakaszban hajtjuk végre, azaz először a nyers enzimet pH =. 4,5 értéken karboximetil-cellulózon adszorbeáljuk, majd pH = 5,5 értékű pufferoldattal eluáljuk, az eluátumot betöményítjük, és a kapott koncentrátumot visszük fel az idézett szabadalmi leírás (ív) lépésében használt oszlopra. A myxobacter AL-1 proteáz II enzimet Wingard, Matsueda és Wolfe módszerével (Journal of Bacteriology, 112, 940-949) állíthatjuk elő myxobacter AL-1 mikroorganizmus-törzsből. A sertés- vagy marha-inzulint az enzim vizes oldatával kezelhetjük, vagy vizes közegben oldódó vagy oldhatatlan hordozóra felvitt enzimmel hozhatjuk érintkezésbe. A kiindulási inzulin és az enzim között végbemenő reakció sebessége és mértéke az enzim : szubsztrátum aránytól, az inkubációs közeg pH-jától és hőmérsékletétől, az inzulin koncentrá-5 dójától, és az inkubálás idejétől függően változik. Általában a lizil-alanin rész lehasításához szükséges Hő csökken az inzulin-koncentráció vagy az enzim : szubsztrátum arány növelésével. A hzil-alanin rész lehasításához szükséges időt az inkubációs kö-10 zeg pH-jának és vagy hőmérsékletének változtatásával is módosíthatjuk. A reakció menetét úgy követhetjük, hogy a reakcióelegyből időről-időre mintát veszünk, és a mintát pH = 2,1 értéken elektroforézisnek vetjük alá, vagy az egyes komponen-15 seket automatikus aminosav-elemző berendezésen elválasztjuk. így könnyen meghatározhatjuk a reakdó végpontját (azaz a lizil-alanin lehasadásának gyakorlatilag teljessé válását), és a reakciókörülmények változásának hatását. 20 Ha enzimként AM proteázt használunk fel, a reakció igen széles enzim: szubsztrátum arány fenntartásával végrehajtható. Jó eredményeket érhetünk el még akkor is, ha 10 000 rész szubsztrá-25 tumra vonatkoztatva mindössze 1 rész enzimet használunk fel. A reakció 3—10 pH-értékű, 10—60 C° hőmérsékletű közegben megy végbe. Adott inzulin-koncentráció esetén a reakció a 4—9 pH-tartományban a leggyorsabb. E pH-tarto-30 mány alacsonyabb értékeinél azonban az inzulin oldhatósága viszonylag csekély, így nagyobb hozam biztosítása érdekében célszerűen az adott pH-tartomány felsőbb értékein végezzük a reakciót, ahol az inzulin oldhatósága nagyobb. Ennek megfelelően 35 a lizil-alanin viszonylag rövid idő (például 3—12 óra) alatt történő, lényegében teljes mértékű lehasadásának biztosítására a reakciót célszerűen a következő körülmények között végezzük: az inzulint az inkubációs közegben való oldhatóságához 40 közel eső koncentrációban használjuk, a közeg pH-ját 7 és 9 közötti, hőmérsékletét pedig 30 Cc és 50 C° közötti értékre állítjuk be, és a lehető legkisebb - például 1 : 1000 vagy kisebb - enzim : szubsztrátum arányt alkalmazzuk. Egy elő-45 nyös eljárásváltozat szerint az inkubációs közeghez 10~2 — 10" 4 mól koncentrációban fémionokat, például kalcium- vagy magnézium-iont adunk. A fémionokat például a megfelelő fémkloridok formájában juttatjuk a rendszerbe. 50 Ha enzimként myxobacter AL—1 proteáz Il-t használunk, a reakciót az AM proteáz enzim alkalmazásánál ismertetettekhez hasonló körülmények között végezhetjük. A reakciót 4-10pH-értékű, 55 25-75 C° hőmérsékletű közegben, még 1:10 000 enzim : szubsztrátum arány betartásával is végrehajthatjuk. A reakciót célszerűen a következő körülmények között végezzük: az inzulint az inkubációs közegben való oldhatóságához közel eső koncent-60 rációban használjuk, a közeg pH-ját 6 és 9 közötti, hőmérsékletét pedig 30 C° és 50 C° közötti értékre állítjuk be, és a lehető legkisebb - például 1 : 1000 vagy kisebb — enzim : szubsztrátum arányt alkalmazzuk. Az inkubációs közeghez fémionokat, pél-65 dául kalcium- vagy magnézium-iont is adhatunk. 2
