170418. lajstromszámú szabadalom • eljárás Rhizopus oryzae törzs lipáz-termelésének növelésére
3 170418 4 enzim-komplexnek két pH optimuma van: pH 3,5-nél és pH 7,5-nél, albumin jelenlétében csak a pH 7,5-nél optimumot mutató enzim működik [Bull. Soc. Chim. Biol. 48, 747-770 (1966)]. Az eljárás további hátránya a viszonylag alacsony 5 termelési szint (275 E/ml). Az 1 442 093 sz. NSZK-beli közrebocsátási irat szerint japán szerzők a Rhizopus delemar törzs felhasználásával állítanak elő lipázt oly módon, 10 hogy dús szerves nitrogén forrást tartalmazó táptalajt alkalmaznak. Az elért termelési szint 740 E/ml. (Egységnyi az az enzimmennyiség, mely 50jumól olajsawal ekvivalens zsírsavat szabadít fel pH = 5,6-nál, 30C°-on, 150 perc alatt olívaolaj 15 szubsztrátból.) Az eljárás hátránya az alacsony termelési szint és a savas működési optimum. 20 1. táblázat Lipáz termelési értékek különböző inokulumokkal NapraLipáz aktivitás forgó(E/ml)+ 0,5% olaj C t Termelő táptalaj naprakonc. adaléka forgóinok. 0,3% 0,3% olaj tápt.-ban PEG++ PPG +++ (%) 0 0,2 0,5 240 261 189 265 395 175 295 485 170 PPG+ Ugyancsak japán szerzők írják le az 1 932 981 sz. NSZK-beli közrebocsátási iratban a Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum törzzsel történő lipáz termelést, állati vagy növényi eredetű olaj és/vagy zsír tartalmú táptalajon. Az elért termelési szint 13 E/ml. (Egységnyi az az 25 (E/ml) enzimmennyiség, mely 60 perc alatt 50 Atmól zsírsavat szabadít fel pH = 7,0 értéknél, 40 C°-on, sertészsír szubsztrátból.) Az eljárás hátránya az igen alacsony termelési érték. 30 A 2 230 724 sz. francia szabadalmi leírás több mikroorganizmus, köztük a Rhizopus arrhizus lipáz termelését ismerteti lipid- (és n-alkán)-tartalmú táptalajon. Jó termelési szintet a Candida lipolytica 35 PEG" törzzsel értek el folyamatos tenyészetben, szénforrásként egy másik törzs, a Candida tropicalis gázolajon mint szénforráson történő tenyészetéből oldószeres extrakcióval kapott lipidet és a kőolaj 250-300 C° között forró n-alkán frakcióját 40 használva. Az eljárás hátránya, hogy igen speciális módszert, a két törzs párhuzamos fermentációját igényli. A találmány célja olyan eljárás kidolgozása, 45 amellyel jelentősen növelhető a Rhizopus oryzae törzs enzimszintézise, és ilyen módon magas aktivitású lipáz oldat készíthető. 50 A találmány alapja az a felismerés, hogy az általunk izolált és Rhizopus oryzae-nek meghatározott törzs lipáztermelő képessége megnövelhető, ha az előfermentációt természetes triglicerid-tartalmú táptalajon végezzük, és ezt követően a 55 főfermentációt meghatározott mennyiségű polietilén-glikol jelenlétében hajtjuk végre. Ekét tényező együttes alkalmazása esetén a fermentációs szint kb. kétszeresére emelhető. Ez a felismerés meglepő, mert nem volt előre várható az, hogy a 60. zsírbontó enzimek fermentálásakor csak az előfermentációban szükséges a természetes triglicerid jelenléte (2. táblázat), ott azonban feltétlenül kívánatos ezt 1—4% mennyiségben alkalmazni, mint az 1. táblázat adatai mutatják. 65 1,0 2,0 4,0 354 560 330 560 310 527 161 165 150 216 220 230 256 230 212 A lipáz aktivitást Desnuelle és munkatársai (Arch. Biochem. Biophys. 83, 309-319 (1959) módosított módszerével mértük. Módosítások: mérési pH 8,5, mérési hőmérséklet 23 C°, és a, mérést 5 percen keresztül végezzük. Egységnyi az az enzim mennyiség, mely 23 C°-on, pH 8,5-nél percenként 1 /nmól zsírsavat szabadít fel emuigeált olívaolaj szubsztrátból. = polietilénglikol = polipropilénglikol 2. táblázat Lipáz termelési értékek különböző adalékanyagok jelenlétében Főfermentációnál használt adalék (0,3%) Lipáz aktivitás (E/ml) 1% napraforgó- napraforgóolaj olaj tart. nélküli előelőferm. fermentációnál O 355 240 napraforgóolaj 250 225 pálmaolaj 232 205 olívaolaj 235 212 sertészsír 230 220 tengeri halolaj 130 135 polipropilénglikol 161 189 polietilénglikol 565 261 2
