170340. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek előállítására N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximid alkalmazásával

3 170340 4 nyös kivitelezési változata szerint úgy járunk el, hogy védett N-terminális csoportot és adott esetben a peptidkémiában szokásos védő csoportokat tartalmazó aminovasat vagy peptidet karbodiimid jelenlétében N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximiddel reagáltatunk, amikor a védett N-terminális aminocsoporttal rendelkező aminosav vagy peptid-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximidésztere keletkezik, majd ezt az N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximidésztert egy szabad N-terminális aminosavat tartalmazó aminosavval vagy pepiiddel, vagy ezek egy származékával reagáltatjuk, és a védett csoportot tartalmazó pepiid jét szabad vegyületté alakítjuk. Védett N-terminális aminocsoportot tartalmazó aminosavként a peptidkémiában szokásosan alkalmazott eljárásokban használt bármely aminosavat használhatunk. Más szóval, a találmány szerinti eljárás során bármilyen és mindegyik olyan vegyületet használhatjuk, amely legalább egy aminocsoportot és egy karboxilcsoportot tartalmaz, még abban az esetben is, ha ezek az aminosavak aszimmetrikus szénatomokkal rendelkeznek, azaz legyen az bármely optikai izomer. Használhatunk bázikus, semleges vagy savas kémhatású aminosavakat. Továbbá, nemcsak aza-aminosavakat, de a ß- és 7-aminosavakat is használhatjuk a találmány szerinti eljárás során. Használhatunk olyan aminosavakat is, amelyek csak szintetikus vagy félszintetikus úton állíthatók elő, például D-fenil-glicint, a-metilalanint, j3-klóralanint, ciklohexilalanint, D-ciklohexilglicint és az ezekhez hasonlókat. Ami a védett N-terminális aminocsoportot tartalmazó peptideket illeti, a találmány szerinti eljárás során bármely olyan peptidet használhatunk, amelyet mind ez ideig felhasználtak az ismert módon kivitelezett reakciókban. Ebből következik, hogy bármely olyan vegyületet, amely a fentiekben ismertetett aminosavakból keletkezett egy vagy több peptidkötés kialakulásával hasonló vagy különböző aminosavakból, előnyösen használhatunk. Ha aminosavakat vagy peptideket az ismert eljárások egyikével vagy másikával kezelünk, legalább az N-terminális aminocsoport védésére, úgy a fent ismertetett védett aminocsoportot tartalmazó aminosavakat vagy peptideket kapjuk. Ezeket a reakciókat könnyen kivitelezhetjük és előnyösen használhatók a találmány szerinti eljárás során. Az N-terminális aminocsoportot védhetjük többek között például karbobenzoxi-, t-butiloxikarbonil-, t-amiloxikarbonil-, p-metoxibenziloxikarbonil-, o-nitrofenilszulfenil- vagy izoborniloxikarbonilcsoporttal stb. Az N-terminális aminocsoport a molekula karboxilcsoportjával létrejövő intramolekuláris acilezéssel is védhető. így, érthetően, a piroglutaminsav N-terminális aminocsoportja nem csupán védőcsoportot átadó vegyületekkel, de molekulán belül acilezéssel is védhető. A védett N-terminális aminocsoporttal rendelkező aminosav vagy peptid karbodiimid jelenlétében kivitelezett reakciója az N-hidroxi-5-norbornén-2,3-karboximiddel az N-hidroxiszukcinimiddel végzett ismert eljárással összhangban végezhető. Karbodiimidreagensként a fehérjekémiában szokásosan használt vegyületek bármelyikét, például a diciklohexilkarbodiimidet, a diizopropilkarbodiimidet vagy a vízben oldódó karbodiimideket, például az N-ciklohexil-N - [ß - (N- metilmorfolinium) - etil] -karbodiimid - p - toluolszulfonátot stb. használhatjuk. Az N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximid és a védett aminocsoportot tartalmazó aminosav vagy fehérje mólaránya a 5 íreakcióelegyben általában (1—2):1, előnyösen (1 —1,4):1. A karbodiimid származék és a védett N-terminális aminosav vagy peptid mólaránya általában 1—2:1. Az észterek előállítására a reakciót —20 C° és 40 C° közötti hőmérsékleten, előnyösen —10 C° és 10 30 C° közötti hőmérsékleten végezzük. A reakcióelegy elkészítése oldószerként tetrahidrofuránt, etilacetátot, dioxánt, acetonitrilt, kloroformot, diklórmetánt, dimetilformamidot stb., vagy ezek elegyét használjuk. A reakció általában 1—6 óra alatt teljes. A 15 reakció lejátszódása után a védett N-terminális aminocsoporttal rendelkező aminosav vagy peptid N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximidésztere az ismert eljárásokkal, például koncentrálással, extrakcióval, kristályosítással, többszöri kristályosítással stb. különíthető 20 el. Ugyanakkor a reakciótermék elkülönítése nélkül közvetlenül felhasználható a következő peptidkapcsolási reakcióban. A védett aminocsoporttal rendelkező aminosav vagy peptid N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximid-25 észterének és egy szabad aminocsoportot tartalmazó aminosav, peptid vagy ezek egy származékának reakcióját az N-hidroxiszukcinimiddel mint N-hidroximiddel végzett ismert eljárásokhoz hasonlóan foganatosítjuk. 30 A fenti védett N-terminális aminocsoporttal rendelkező aminosavnak vagy pepiidnek az N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximidészterével reagáló szabad N-terminális aminocsoporttal rendelkező aminosavat vagy peptidet az előzőekben felsorolt aminosavak 35 vagy peptidek közül választhatjuk. Ami a szabad N-terminális aminocsoportot tartalmazó aminosav- és peptidszármazékokat illeti, a találmány szerinti eljárás során olyan szubsztituált vegyületeket használhatunk, amelyek a reakciót nem gátolják. Származékként 40 előnyösen sókat, amidokat vagy ezekhez hasonló vegyületeket használunk. A találmány szerinti eljárás egyik előnye, hogy vizes oldószerekben oldódó aminosav- vagy peptidsókat használhatunk. Sóként előnyösen szervetlen 45 vagy szerves bázissal alkotott sókat, például nátrium-, kálium-, magnézium-, kalcium-, trietilamin-, tributilamin-, N-metilmorfolin-, N-etilmorfolin-, trimetilamin-, N-metilpiperazin- vagy diciklohexilaminsókat használunk. 50 Amidként olyan amidokat. használunk, amelyeket egy aminosav vagy egy peptid karboxilcsoportjának ammóniával való reagáltatásával állítunk elő, úgyszintén a megfelelő primer vagy szekunder amidokat. A reakcióelegyhez adagolt aminosavak és peptidek, 55 mind a védett aminocsoportot tartalmazó aminosavak és peptidek, mind a szabad aminocsoportot tartalmazó aminosavak, peptidek és ezek származékai az oldalláncaikban funkcionális csoportokat tartalmazhatnak, mint például a lizin £-aminocsoportot, az 60 arginin quanidinilcsoportot, a glutaminsav 7-karboxilcsoportot, tiol-, karbonil- vagy hidroxilcsoportot stb.; az N-terminális aminocsoporton kívül a C-terminális karboxilcsoport és ezen funkcionális csoportok egyike vagy mindegyike előnyösen védett. A védett ami-65 nocsoporttal rendelkező aminosavakkal vagy peptidek-2