170333. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fenilgilicin optikailag aktív izomerjei előállítáásra
5 170333 6 D-fenilglicint üvegszűrőn felfogjuk, és a szűrőn 5 ml vízzel mossuk. A D-feliglicin hozam 0,35 gramm (hatásosság = 81%). Ennek a D-fenilglicinnek a fajlagos forgatóképessége: [a]$ = -147° (c= 0,6 2 n sósavban). Beilstein 14 III, 1187. old. szerint a fajlagos íorgatóképesség: [a]$ = -153° (c = 0,6, 2 n sósavban). Az eljárás szelektivitása D-fenilglicinre nézve, %-ban: 98. 3. példa 5,0 mg mól (930 mg) Dl-fenilglicinamid-hidroklorid, 50 mg magnézium-klorid és körülbelül 0,2 mg mangán-klorid 100 ml vízzel készített oldatának a pH-ját 1 n nátrium-hidroxid-oldattal 8,0-as értékre állítjuk be. A kapott oldathoz 250 mg leucin-aminopeptidázt adunk (Merck 25 010), amely kovalensen kötődik 3-amino-propil-trimetoxiszilil Bio-üveghez (0,3 súly% terhelés; előállítása a Biotechnology and Bioengineering Vol. XVI, 275-77. old., 1974 szakirodalmi helyen van leírva), és az oldatot 18 óra hosszat keverjük szobahőmérsékleten. Az üvegporhoz kötött leucin-aminopeptidázt szűrjük, majd a szűrletet az 1. példában megadott körülmények között vékonyréteg-kromatográfiásán elemezzük. Az elemzés azt mutatja, hogy a DL-fenilglicinamid egyenértéknyi mennyiségű L-fenilglicinné és D-fenilglicinamiddá alakult a kovalensen üveghez kötött leucin-aminopeptidáz segítségével. A szűrlet pH-ját 1 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,0-es értékre állítjuk, és 100 g Amberlite I.R.C-50 H+ alakú ioncserélőn átengedjük. Ezután 100 ml vizet engedünk át az ioncserélőn, az eluátumot vákuumban 15 ml-re betöményítjük, és az L-fenilglicint szűréssel elkülönítjük, így 0,34 g vékonyrétegkromatográfiásán tiszta L-fenüglicint kapunk. A kapott L-fenilglicin fajlagos forgatóképessége: [a]g = +157° (c = 1,6, 2,6 súly% sósavban). Beilstein 14 III, 1188. old. szerint a fajlagos forgatóképesség: HD = +157,5° (c = 1,6,2,6 súly% sósavban). Az eljárás szelektivitása L-fenilglicinre nézve, %-ban: 99,8. Az Amberlite I.R.C.-50-hez kötött D-fenilglicinamidot 150 ml 0,5 n kénsavval extraháljuk. Az extraktumot vákuumban 10 ml-re betöményítjük és utána 1 óra hosszat forraljuk, majd lehűtjük és tömény, vizes ammóniával semlegesítjük. A kikristályosodott D-fenilglicint üvegszűrőn szűrjük, és a szűrőn maradt anyagot 5 ml vízzel mossuk. A D-fenilglicin hozam 0,33 g (hatásosság = 90%). Fajlagos forgatóképesség: [a]p = -152° (c= 0,6,2 n sósavban). Beilstein 14 III, 1187. old. szerint a fajlagos forgatóképesség: MD = _ 153° (c = 0,6,2 n sósavban). Az eljárás szelektivitása D-fenilglicinre nézve, %-ban: 99,2. 4. példa 0,5 mg leucin-aminopeptidázt (Serva 27 717; ökörszemből) hozzáadunk 1,62 mg mól (0,3 gramm) DL-fenilglicinamid-hidroklorid, 1.2 mg magnéziumklorid és 0,3 mg mangán-klorid 35 ml 1. példa szerinti pufferoldattal (bórsav-kálium-klorid-nátrium-hidroxid) készített oldatához szobahőmérsékleten és 8,1 5 pH-érték mellett keverés közben egy keverővel felszerelt reakcióedényben. A reakcióelegy pH-ját 15 perc leforgása alatt 8,6 értékre emeljük, és ezen az értéken tartjuk. Az 1. példa szerinti körülmények között végzett 10 vékonyréteg-kromatográfiás elemzés azt mutatja, hogy a reakcióelegy mólegyenértéknyi mennyiségben L-fenilglicinből és D-fenilglicinamidból áll 45 perc után és 4 óra után. Az aminosavelemzés, amelyet 6 órás reakcióidő után készítünk, ugyanazt az ered-15 ményt. adja, mégpedig 0,35 súly% L-fenilglicin (hozam = 100%), 0,34 súly% D-fenilglicinamid (hozam = 99%). 5. példa 20 1,6 mg mól (0,3 g) DL-fenilglicinamid-hidrokloridot feloldunk 30 ml 7,0-es pH-jú 1. példa szerinti pufferoldatban (bórsav-kálium-klorid-nátrium-hidroxid). Az oldathoz hozzáadunk 1,0 ml 0,125 mólos magnézium-klorid-oldatot, és 0,1 ml 0,025 mólos 25 mangán-klorid-oldatot, majd pedig 0,8 mg aminopeptidáz M-t (Enzyme Commission number 3.4.11.2 aminopeptidáz, sertésveséből, Sigma, nr. A—7761). Ezután a pH-t 7,1-re állítjuk, és az elegyet 21 óra hosszat keverjük. Ezalatt az idő alatt a pH fokozato-30 san 7,45 értékre növekszik. A reakcióelegy egy mintáját az 1. példa szerinti körülmények között vékonyréteg-kromatográfiásán elemezzük. Az elegy 2 óra után 3 mól% fenilglicint és 20 óra után 50 mól% fenilglicint tartalmaz. 35 A keverést tovább folytatjuk, az aminosav-elemzés 0,34 súly% fenilglicint és0,40 súly% fenilglicinamidot mutat, 24 óra után. 100 óra múlva a fenilglicin-tartalom 0,45 súly%, a fenilglicinamid-mennyiség pedig 0,35 súly%. 40 Láthatjuk, hogy ez az enzim — bár nem hatástalan, — de hatása gyengébb, mint az előző példákban bemutatott leucin-aminopeptidáz hatása 45 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás fenilglicin optikailag aktív izomerjeinek előállítására, DL-fenilglicinamid szelektív hidrolízise útján, azzal jellemezve, hogy a DL-fenilglicinamidot 50 valamely aminopeptidázzal hidrolizáljuk, a D-fenilglicinamidot ismert módon elkülönítjük és D-fenilglicinné hidrolizáljuk, az enzimatikus hidrolízis során kapott L-fenilglicint pedig ismert módon kinyerjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási 55 módja, azzal jellemezve, hogy alkalmas aminopeptidázként leucin-aminopeptidázt használunk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az enzimes hidrolízist 7-9,5 pH-n és 20-40 C° hőmérsékleten 60 hajtjuk végre. 4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az aminopeptidázt ismert módon oldhatatlanná tett formában alkalmazzuk. A kiadásért felelős a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 77-2696 - Dabasi Nyomda, Budapest - Dabas Feleló's vezető': Földes György igazgató
