170275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin készítmény előállítására azonos szerkezetű inzulinból
170275 méretű, legfeljebb 340 7/IOO N.E. cinkiont tartalmazó inzulinkristályok szuszpenziójába 60 ; 40 -80 : 20 arányban amorf dez-fenilalaninB1 -inzulint adunk, a keveréket 6,8-7,6 közötti pH értékre állítjuk be és 40—80 N.E./ml inzulintartalomra hígítjuk. A 200 7/N.E., vagyis 80 mg/ml cinknek megfelelő koncentrációban cinkionokat tartalmazó kristályszuszpenzió még sókat, mint nátrium-acetátot, előnyösen 0,1-0,2%, vagy nátrium-kloridot, célszerűen 0,5—1% koncentrációban és/vagy konzerválószereket, mint 4-hidroxi-benzoesav-rnetil-észtert, célszerűen körülbelül 0,5% koncentrációban tartalmaz. A készítmény összetétele bizonyos határok között változtatható. A kristályos inzulin és az amorf dezfenilalaninB1 -inzulin arányát a kívánt hatásidőtartam szabja meg. Ez az arány körülbelül 60-40 és 80-20, előnyösen 70: 30, 75 : 25 között ingadozhat. A készítmény összes inzulintartalma célszerűen 40 - 80 N. E. /ml-ig terjedhet. A dez-fenilalanin81 -inzulin a szakirodalomból ugyan ismert vegyület, azon tulajdonsága azonban ezidáig nem vált ismeretessé, hogy azonos szerkezetű kristályos inzulinokkal stabil kétfázisú rendszer alkotására képes. A találmány szerinti készítményeknek hosszan tartó inzulin-depó hatása van. A készítmény 25 °C-on egy évig tartó tárolás után sem fizikai állapotában, sem biológiai hatásában nem változik. A készítményt depóinzulinként a diabetes mellitus kezelésére alkalmazzuk. Különösen alkalmas páciensek vércukorszintre való újrabeállításánál, mivel ilyen esetben meg kell akadályozni azt, hogy több inzulinfajta ellen antitestek keletkezzenek. A következő példák a találmány szerinti készítmény előállítását ismertetik. 1. példa A) Cinkinzulin-krisztályszuszpenzió előállítása Szárazanyagra számítva 25 N.E./mg minimális aktivitású 16 g tiszta kristályos inzulint cink-klorid alakjában 0,013% cinkionokat tartalmazó 750 ml 1/50 n sósavban feloldjuk. Ehhez az inzulinoldathoz 250 ml 0,95% jégecetet és 2,8% nátrium-kloridot tartalmazó oldatot adunk hozzá. A tiszta oldatot ezután sterilszűréssel membránréteg segítségével csíramentésítjük. A steril szűrt oldathoz olyan mennyiségű steril 4 n nátrium-hidroxid-oldatot adunk, hogy 5,4—5,6 közötti pH-értéket érjünk el. A kapott amoíf insulinszuszpenziót rövid ideig steril körülmények között szobahőmérsékleten keverjük, majd jégszekrényben +4—+7 C° között kristályosításra félretesszük. Legfeljebb 36-40 óra eltelte után 18-30 mikron közötti egységes méretű és egyenletesen képződött romboéderes kristályokat kapunk. A kristályokat lassú fordulatszám mellett steril poharakba centrifugáljuk, mimellett a még esetlegesen jelenlevő csekély amorf anyagot elválasztjuk. A lecentrifugált kristályos terméket ezután 1 liter steril, pufferezett semleges inzulin hígítóoldatban (amelynek összetételét az 1. táblázatban adjuk meg) újra szuszpendáljuk (törzsszuszpenzió). 1 táblázat Az inzulin hígítóoldat összetétele: 10 liter oldat a következő komponenseket tartal-5 mázza: 10 g Solbrol M (p-oxi-benzoesav-metilészter) =0,1% 14 g nátrium-acetát 10 +3H2 0p.a. = 0,14%=0,01 mól 75 g nátrium-klorid p.a. ' = 0,75% 1,66 g cink-klorid = 80 Zn^/ml 15 nátrium-hidroxid-oldattal 7,4 pH-értékre beállítva és sterilen szűrve. A törzs-szuszpenzió inzulinkristály tartalmának meghatározása: A törzs-szuszpenzió inzulinkristály tartalmának 20 meghatározására a kristályos szuszpenziót egy mágneskeverő segítségével négyszer élénken átkeverjük és mindig l-l ml (teljes pipetta) mintát veszünk, amelynek inzulintartalmát a következő módszerekkel határozzuk meg: 25 1. Aceton és éter szárítás után gravimetriás mérés alapján. 2. A kristályok feloldása után spektrofotometriás úton 280 millimikron UV hullámhosszon. 3. A N-tartalom meghatározása alapján. 30 40 N.E./ml koncentrációjú depókomponens előállítása: A törzs-szuszpenzió megállapított inzulintartalma alapján ahhoz steril hígítóoldatot adunk hozzá és így a kívánt 40 N.E./ml inzulintartalomra beállítjuk. Az 35 össztérfogat legfeljebb 10 liter. B. A dez-fenilalaninB l-inzulin amorf komponens előállítása 6,304 g dez-fenilalaninB1-inzulint 3,5 liter 2. táblázatban megadott összetételű oldófolyadékban 40 feloldjuk. 2.táblázat A dez-fenilalaninB1 -inzulin oldófolyadék összetétele: 45 5 liter oldat a következő komponenseket tartalmazza: 5 g Solbrol M (p-oxibenzoesavmetilészter) = 0,1% 2,8 5 ml j égecet ~ 0,14% nátrium-50 acetát+ 3H2 0 37,5 g nátriumklorid =0,75% 830 mg cinkklorid (vízmentes) = 80 Zri^/ml 2,6 ml 4 n sósav 55 A dez-fenilalaninB1 -inzulin tiszta oldatát ezután membránszűrő segítségével csíramentesítjük, majd 400 ml oldófolyadék hozzáadása után - amelyet az inzulin szűrése után ugyanazon steril szűrőn csíramentesítünk — 3,9 liter össztérfogatra beállítjuk. 4 n steril 60 nátrium-hidroxid hozzáadásával 7,4 pH-értéket állítunk be (nátrium-hidroxid fogyasztás 13,6 ml). 34 ml steril, semleges inzulin hígítóoldat további hozzáadásával 3,948 liter végtérfogatot állítunk be és így 40 N.E./ml inzulintartalmat, amely 25 N.E./mg dez-fenil-65 alanin B1-inzulin kiindulási aktivitásnak felel meg. 2
