170269. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(béta-fenoxi-acetamido-3-alkil- cef-3-em-4-karbonsavak N-dezacilezésére

170269 7 8 tát-pufferrel (pH-ja 5) szemben dializáljuk. A dialízis után az így kapott extraktum millilitereként mintegy 7 egység amidohidrolázt tartalmaz. b) 10 g (27 mmol) 7-(/3-fenoxi-acetamido>3-metilcef-3-em-4-karbonsavat 250 ml vízben 37 °C-on hidrolizálunk. A víz 30 mmól ecetsavat (pH-ját előzetesen nátrium-hidroxiddal 4,5-re beállítottuk), 100 /miól vas(II)-szulfátot, 1,4 mmól /3-merkapto-etanolt és 1350 egység amidohidrolázt tartalmaz. 37 °C-on végzett 2 órás inkubálás után az oldatot 100 °C-on hevítjük 5 percen át, majd pH-ját 5-re beállítjuk kálium-hidroxiddal. Az ekkor koagulálódott fehérjéket centrifugálás útján (800 g 5 percen át) elkülönítjük, majd az így kapott felülúszó fázist 100 ml-re betöményítjük és 15 X 2,5 cm méretű, Dowex-1 márkanevű anioncserélő gyantával (acetátionokkal töltött állapotban) töltött oszlopra felvisszük. A 7/3-aminc-3-metil-cef-3-em-4-karbonsàvat 1 mólos ammónium-acetát-oldattal eluáljuk. A terméket tartalmazó eluátum-frakciót szárazra pároljuk, és az ammóniumacetátot vákuumban eltávolítjuk. A kapott 7/3-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavat ezután feloldjuk 100 ml 8 pH-értékű vízben, majd a vizes oldat pH-ját 3,5-re beállítjuk 5 N sósavoldattal. Az ekkor képződött csapadékot 0 °C-on kiszűrjük, hideg 1 mólos sósavoldattal, acetonnal és éterrel mossuk, majd szárítjuk. így 3,73 g, 16 mmól 7/3-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavat tartalmazó csapadék különíthető el (hozam 59%). A terméket papirkromatográfiás úton azonosítjuk. Whatmann 3 MM típusú papírt pH 6-értékű, 50 mmól-os foszfátoldattal (literenként 5,9 g kálium-dihidrogén-foszfátot és 1,85 g dinátrium-dihidrogénfoszfátot tartalmaz) pufferolunk. Miután 1-butanolt, etanolt és vizet 4 : 1 :5 arányban tartalmazó elegyből álló szerves fázist futtattunk a papíron egy éjszakán át, a termék ibolyántúli fényt abszorbeáló foltként jelentkezik. Ez a folt ninhidrinnel barnára színeződik és Rf értéke azonos a 7/3-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav egy hiteles mintájának Rf értékével. Az így elkülönített termék és egy hiteles minta magmágneses rezonancia-spektrumának, ultraibolya-spektrumának és infravörös spektrumának összehasonlítása is igazolja az azonosságot. A hiteles minta azonosítási adatait lásd Stedman és munkatársai cikkében [J. Med. Chem., 7,117/1964)]. 2. példa 7/3rAmino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav előállítása Erwiniá aroideae által termelt enzimet tartalmazó cellulóz-triacetát-rostokat használva a) 130-140 liter mennyiségű fermentléből eltávolítjuk az Erwinia aroideae baktérium (NRR1 B—138, ATCC—25206) sejtjeit centrifugálás útján 6300 fordulat/perc sebességgel működő"Westfalia KO2006 típusú centrifugát használva. A mintegy 4 kg súlyban kapott sejtekből ezután 10 vegyes%-os szuszpenziót készítünk hideg (5 °C-os), 20 mmólos imidazol-hidroklórid-pufferrel (pH-ja 5,0), amely még 2 mmól (0,8 g/liter) vas(II)-ammónium-szulfátot és 5 mmól (0,35 g/liter) /3-merkapto-etanolt tartalmaz, 15 percen át Silverson AX típusú keverőberendezést használva. A bakteriális eredetű sejteket ezután elroncsoljuk úgy, hogy a fenti szuszpenziót A.P.V. KF3 típusú homogenizátoron 525-560 kg/cm^ üzemi nyomás mellett háromszor átbocsátjuk, amikor is a homogenizátorból távozó folyadékot hőcserélőn átvezetve hűtjük. A homogenizált szuszpenzióhoz ezután 0,5% mennyiségben cetil-trimetil-ammónium-bromidot (5%-5 os oldata formájában) adunk lassan, majd a szuszpenziót 16 órán át állni hagyjuk a csapadékképződés elősegítésére. A szuszpenzióhoz ezután 0,5 ml/liter mennyiségben polietilén-glikol (P2000) habzásgátlót adunk, majd a sejtmaradványokat és a kicsapott 10 fehérjéket centrifugálás útján elkülönítjük ismételten Westfalia KO20Ö6 típusú centrifugát használva. Az így kapott oldathoz 2 mmól vas(II)-ammóniumszulfátot és 5 mmól j3-merkapto-etanolt adunkj majd az oldatból az enzimet kicsapjuk, két lépésben hideg 15 izopropanolt adagolva az oldathoz 40 térfogat% izopropanol adagolása után csaknem inaktív anyag csapódik ki (ezt a fenti típusú centrifugával elkülönítjük), majd további 100 térfogat% izopropanol adagolásával az aktív frakciót is kicsapjuk. 20 Az így kapott, 140% izopropanol adagolása után kapott csapadékot először 5 percen át Vortex-típusú keverőberendezést, majd másodszor 16 órán át 4 °C-on egy mágneses keverőt alkalmazva extraháljuk 20 mmól-os imidazol-hidroklorid-pufferrel (pH-ja 5,0), 25 amely még 2 mmól vas(II)-ammónium-szulfátot és 5 mmól /3-merkapto-etanolt tartalmaz. Az első extrakciót a csapadékhoz viszonyítva 10 vegyes% puff érrel, míg a második extrakciót 20 vegyes% pufferrel végezzük. Az extraktumból az oldhatatlan anyagot 16 30 órán át végzett centrifugálással (2100 g, 4 °C) különítjük el. Az így kapott tömény enzimoldathoz ezután lassan 1,25-szörös feleslegben vett hideg izopropanolt adunk, majd a kivált csapadékot 10 percen át végzett centri-35 fugálás (2100 g, 4 °C) útján különítjük el. Ezt a csapadékot ezután mintegy 1 liter térfogatú 20 mmólos imidazol-hidroklorid-pufferrel) vas(H)-ammóniumszulfátot és /3-merkapto-etanolt is tartalmaz a már említett mennyiségben) extraháljuk a fentiekben is-40 mertetett módon. A kapott extraktumból az izopropanol feleslegét forgó bepárlóban eltávolítjuk, majd 16 órán át végzett centrifugálás (23000 g) után az oldatot fagyasztásos szárításnak vetjük alá. 45 b) A fagyasztva szárított amidohidrolázt feloldjuk 50 mmól-os, 0,2 mmól vas(II)-ammónium-szulfátot és 30 térfogat% glicerint tartalmazó acetát-pufferben (amelynek pH-ját előzetesen nátrium-hidroxiddal 5,0-ra beállítottuk), Az így kapott, milliliterenként 50 mg 50 fehérjét tartalmazó oldatot ezután a 782 646 belga szabadalmi leírás 1. példájában ismertetett módon cellulóz-triacetátból készült rostokkal rögzítjük. A rostokat (szárazsúly 0,29 g, aktivitás 70 egység/mg) 1,25 cm átmérőjű csőbe helyezzük, majd a 55 csövön át 50 mmól-os, 0,2 mmól vas(II)-ammóniumszulfátot és 1 mmól ditiotreitet tartalmazó acetátpuffért (pH-ja 5,0) keringtetünk. 1 g 7-(/3-fenoxi-acetamido)-3-metü-cef-3-em-4-karbonsavat feloldunk pH 5,5-en 60 ml, 7,5 mg ditiotreitet és 0,4 mg vas(II)-60 ammónium-szulfátot tartalmazó vízben, majd az így kapott oldatot felmelegítjük és a fenti puffer helyett a csövön át keringtetjük. Az oldat hőmérsékletét a keringtetés közben 37 °C-on tartjuk. A felszabaduló fenoxi-ecetsavat pH 6,0-án titráljuk 0,9 N ammónium,65 hidroxid-oldattal. 3 óra alatt a szubsztrátum 58%-a 4