170227. lajstromszámú szabadalom • Eljárás D-ribóz előállítására
170227 között Bacillus törzseket is használnak, anélkül azonban, hogy azok biokémiai funkcióit közelebbről meghatároznák. A spóraképződési képesség megléte ezeknél a törzseknél nyilvánvaló legalább abból a tényből, hogy a spóraképződés a Bacillus nemzetséghez tartozó mikroorganizmusoknak egyik legfőbb jellemvonása, és abból az általános tapasztalatból is, hogy általában, ha a Bacillus nemzetség esetében egy jnunkában nincs speciális utalás a spóraképzésre, a szóban forgó mikroorganizmus képes a spóraképződésre [Bergey's 10 Manual of Determinative Bacterology, 7 thed., 613 (1957)]. Ezek az ismert törzsek igen csekély 2-dezoxi-D-glukóz-oxidáz aktivitással bírnak, enzimaktivitásuk a későbbiekben leírt vizsgálat szerint mérve 0,01-0,02 (mmól/perc) protein mg. Az ezekkel a módszerekkel kapott D-ribóz mennyiség alacsony, körülbelül 35,3 mg/ml. • A törzsek 2-dezoxi-D-glukóz-oxidáz aktivitása és a kapott legnagyobb mennyiségű D-ribóz az előbb említett első két módszer esetében az alábbiakban látható: Mikroorganizmus 2-dezoxi-D-glukóz oxidáz aktivitás [//mól/perc/mg protein] összegyűlt D-ribóz [mg/ml] 1 255 254 sz. nagy-britanniai Bacillus pumilus IFO 12 600 szabadalmi leírás Bacillus pumilus IFO 12 601 Bacillus pumilus IFO 12 602 Bacillus subtilis IFO 12 603 Bacillus subtilis IFO 12 604 0,01 0,02 0,01 0,01 0,01 28,5 30,5 29,3 26,5 29,5 Agricultural and Biological Chemistry 35, 509 (1971) Shi 5 Bacillus Shi 7 Bacillus Shi 34 Bacillus 0,01 0,02 0,01 28,4 35,3 24,8 A D-ribóznak a Bacillus nemzetség törzseivel való előállítására vonatkozó kutatásokban a feltalálók azt 30 tapasztalták, hogy a Bacillus nemzetség azon mutánsai, amelyek egyidejűleg a transzketoláz- és epimerázaktivitás közül legalább az egyikkel nem rendelkeznek, és hiányzik a spóraképződési képességük és/vagy nagy 2-dezoxi-D-glukóz oxidációs aktivitásúak, szo- 35 katlanul magas D-ribóz előállító képességgel bírnak. A további kutatás és ennek alapján a találmány szerinti eljárás kidolgozása azt eredményezte, hogy a D-ribóz nagy, körülbelül 65-70 mg/ml-es mennyiségben állítható elő. 40 A mikroorganizmusokkal történő D-ribóz előállítási módszerek pedig nem foglalkoztak a spóraképzési képességgel és a D-ribóz hozamával — a találmány az ilyen kutatások első eredménye. Amellett, hogy a találmány szerinti eljárással megnövekedett D-ribóz 45 hozam érhető el, további előnyt jelent, hogy nyilvánvalóan nincs szükség a spórák eltávolításának nehézkes műveletére és így igen könnyű a termék kinyerése. A spóraképződés hiánya mint kifejezés azt jelenti, 50 hogy ha a populáció teljes életképességét és a spóraszámot az alábbiakban leírt módszerrel mérjük, amely módszer analóg a Journal of General and Applied Microbiology-ban [16. kötet 430, 431 (1970)] leírt módszerrel, a spóraszám osztva a populáció összsejt- 55 számával, vagyis a „spóraképződési szaporaság" nem nagyobb, mint 10-4. A spóraképződési szaporaság meghatározása A törzs — amelynek spóraképzési szappraságát meg akarjuk határozni — ferde tenyészetének kacsnyi 60 mennyiségét (a hurok átmérője 4 mm) 5 ml módosított Schaeffer táptalajba oltjuk. [a National Academy of Sciences of the U.S.A. kiadványai, 54. kötet, 704 o. (1965)], amely 1,0% D-glukózt, 0,8% Difco táptalajt, 0,01% 3,4,5-trihidr- 65 oxi-l-ciklohexén-1-karbonsavat (sikiminsav), 0,025% MgSo4 -7H 2 0-t, 0,1% KCl-t, 10"6 M FeCl3-6H 2 0-t, 10~3 M CaCl2-2H 2 0-t és_ 10~ s M MaCl2-H 2 0-t tartalmaz; ezek közül a CaCl2 *2H 2 0-t és az MnCl 2 • •4H2 0-t külön-külön sterilizáltuk. Sterilizálás előtt a táptalaj pH-ját 7 értékre állítjuk be. A 37 C°-on történő 3 napos inkubáció után a tenyészetet két 2,5 ml-es részre osztjuk, és az egyiket 30 percre 80 C°-ra hevítjük. Mind a fel nem melegített tenyészetet (teljes életképesség), mind a felmelegített tenyészetet (spóraszám) megfelelő módon felhígítjuk és módosított Schaeffer agar táptalajra oltjuk, amelyet úgy készítünk, hogy 2% agart adunk az előbb leírt módosított Schaeffer táptalajhoz. 37 C°-on 2 napig tartó inkubálás után megszámoljuk az élő sejteket. A vizsgált törzs spóraképződési szaporasága a spóraszám osztva a populáció teljes életképességével. A leírásban a transzketoláz vagy epimeráz hiánya azt jelenti, hogy ha az alábbi módszerrel — amelynek elve a Journal of Biological Chemistry-ben: 223,1009 (1956), valamint az Archieves of Biochemistry and Biophysics-ben: 74 kötet, 306 o. (1958), és 74. kötet, 315 o. (1958) van leírva - mérjük a nikotinamidadenin-dinukleotid (későbbiekben NADH) redukált alakjának oxidált mennyiségét és kiszámítjuk az enzim-aktivitást az alábbi leírt módon készített (A) sejt-extraktumra vonatkozóan, ez az érték nem több, mint 0,01 Mmol/perc/protein mg. (I) Eljárás (A) sejt-extraktum készítésére: A törzs ferde tenyészetével — amelynek transzketoláz vagy epimeráz aktivitását meg akarjuk határozni - beoltunk egy táptalajt (pH = 7 érték), amely 2,0% szorbitot (Woko Pure Chem. Ind. Ltd.), 0,1% nátrium-L-glutamátot, 0,1% KH2S0 4 -ot, 0,3% K2 HP0 4 -ot, 0,5% (NH4) 2 S0 4 -ot, 0,1% MgS0 4 -et, 0,001% FeS04 -7H 2 0-t, 0,001% ZnS04 -7H 2 0-t, 0,001% MnS04 -4-6H 2 O-t, 100-4000; /ig/1 biotint, 2
