170135. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vinkadiolin kinyerésére és tisztítására
170135 és 1745 és 1725 cm^-nél /észter karbonil/. Mágneses magrezonancia spektruma a következő jellemző rezonancia-frekvencia-eltolódásokat mutatja: cT 7 ,13 7 ,53 8 ,o4 3 ,60 6, .61 6, o9 3, 79 2,7o 3,79 9,77 5,47 2,o9 0,80 5,85 5,29 2,63 3,84 0,91 Hidrogén helye C-ll\ 12', 13' C-14' N a 16*-nál metilesoport /metil--észterből C-17'-en C-14 C-18 C-16 metoxicsoportb<51 származó metilesoport N-en levő N-metilcsoport C-3 metil-észter metilesoportja OH C-3-on C-4 acetát C-4-en CH,-CH„ C-5-ön C-6 d C-7 C-19 C-3' CH^—CH« C-4'-en A fentiek alapján a vinkadiolin szerkezete az I képlettel irható le. A vinkadiolln molekulasúlya tömegspektrométerrel meghatározva 826, m/e = 826 alapján /e=ion töltése, m=ion tömege/, megfelelően a c46 H Rft N A°ln molekuláképletnek. A tömegspektrograffi Ség 17o és 371 fajlagos töltésű ionok jelenlétét is mutatja. A C-4' sztereokémiáját annak alapján állapitottuk meg, hogy a C-4' helyzetben nem sikerült acetátot képeznünk, ami -hidroxilcsoport jelenlétét mutatja /a vinkalenkoblastinhoz és leurocristinhez hasonlóan/. A leurosidinben levó C-4' helyzetű -hidroxilcsoport hasonló reakciókörülmények között könynyen képez acetátot. A C-3' helyzetű liidroxilcsoport ilyen körülmények között acetátot képez, ami tömegspektroszkópiával könnyen kimutatható. Ezen acilezett termék mágneses magrezonancia spektruma acetátcsoportnak tulajdonitható uj sávot mutat 1,85-nél és a C-3' helyzetű protonnak megfelelően eltolódást 3,84-ről 4,48-ra. A vinkadiolin gyógyszerészetileg elfogadható savaddiciós sókat képez nem-toxikus ásványi savakkal, mint kénsavval, hidrogén-kloriddal, hidrogén-bromiddal, foszforsavval és hasonlókkal. A vinkadiolin vizmentes etanollal készült oldatát 1 ^-os etanolos kénsavoldattal kezelve vinkadiolin-szulfátot kapunk amorf por alakjában. Vinkadiolint például a következő eljárással állítunk elő: nyers vinka-alkaloidokat tartalmazó Vinca rosea /Catharanthus roseus/ leveleit vizzel nem elegyedő oldószerrel,mint benzollal extraháljuk. A benzolt vizes borkősav oldat jelenlétében ledesztilláljuk az elegyből. A kapott vizes savas kivonat pH-ját körülbelül 6-ra állítjuk be. ügy is eljárhatunk, hogy a leveleket vizes savval kezeljük körülbelül pH 3-nál és a képződött vizes fázist benzollal extraháljuk. A benzolos fázist elválasztjuk és elöntjük, és a vizes fázis pH-ját az előbbiek szerint körülbelül 6-ra állítjuk be. A dimer alkaloidokat ezután szerves oldószerrel, igy benzollal vonjuk ki a vizes fázisból. A kivont alkaloidot keresztkötéseket tartalmazó dextrán-gélen /Sephadex G-25 P/ szűrjük, mozgó fázisként 0,1 mól ammónium-citrát-puffert pH - 3/ használunk. A gélszüréses kromatográfiai normál nyomáson hajtjuk végre. Az eljárás során először a vinkristint, vinblastint, dez-N-metil-vinblastint, leuroformint, leurosint és vinrosidint tartalmazó dimer alkaloid-frakciókat eluáljuk. A dimer alkaloidokat a pH - 3 pufferból ugy vonjuk ki, hogy a pH-t lúggal 7,ora állitjuk be és a képződött vizes oldatot vizzel nem elegyedő oldószerrel, előnyösen 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 benzollal extraháljuk. A benzol bepárlása után kapott maradékot etanolban oldjuk, melyből a leurosin közvetlenül kikristályosodik. A leurosinkristályokat dekantálással elválasztjuk és a kapott felüluszót pH 4,2-ig 3 í-os etanolos kénsavoldattal megsavanyitva a visszamaradó dimer alkaloidokat szulfátsókká alakítjuk át. A kivált sókat összegyűjtjük és a megfelelő szabad alkaloid-bázisokká alakítjuk át standard módszerek segitségével, például ugy, hogy a sókat vizben oldjuk, a pH-t ammónium-hldroxid-oldattal 8,0-ra állítjuk be és a dimer alkaloidokat vizzel nem elegyedő szerves oldószerrel, előnyösen metilén-kloriddal vonjuk ki. A metilén-kloridot bepárolva dimer alkaloid-keveréket kapunk, amelyet azután nagy nyomáson aluminium-oxidon /Hl. aktivitás/ kromatografálunk, eluensként etil-acetát/metilén-klorid/viz /25:75:o,4/ oldószer-rendszert használva. A kromatográflánál előnyösen lo,2-23,8 atm nyomást alkalmazunk. Alkaloidok általában hatásosabban választhatók szét nagyobb nyomásokon. A nagy nyomású kromatografiát nyomásálló szerelvénnyel ellátott rozsdamentes acél-készülékben hajtjuk végre. A kromatográfiás eljárásban az alkaloidokat a következő sorrendben eluáljuk: maradék leurosin, vinblastin, dez-N-metil-vinblastin, vinkristin és vinrosidin. Az eluált frakcióban a dimer alkaloidok ismert standard módszerek segitségével, például vékonyrétegkromatográfiával azonosítjuk. Az ismert alkaloidok eluciója után az oszlopon több polárisabb dimer alkaloid marad vissza. Ezeket metanollal eluáljuk és mindaddig ujrakromatografáljuk, amig a vincadiolint különálló, a poláris alkaloidfrakciőban jelenlevő többi dimer alkaloidtól mentes frakció formájában meg nem kapjuk. A következő példa a találmány további ismertetésére szolgál. Példa Vinkadiolin lboo kg száraz Vinca Rosea levelet ötször l-l óráig extrahálunk, kivonó közegként 28 ?£os /súly per térfogat/ ammónium-hidroxid-oldattal meglugositott 28 térfogat benzolt használva. A benzolos kivonatokat a rostos anyagról dekantáljuk, egyesitjük és szűrjük. A szürletet 3 £-os vizes borkősavoldat felett lepároljuk, a vizes oldatot szűrjük és a. szürletet pH 3,I-nél azonos térfogatú benzollal kétszer extraháljuk, a benzolos kivonatokat elválasztjuk és elöntjük. A szürlet pH-ját tömény ammónium-hidroxiddal 6,0-ra állitjuk be. A vizes fázist pH 6,0-nál háromszor extraháljuk azonos térfogatú benzollal. A benzolos kivonatokat egyesitjük és vákuumban bepárolva maradékként 4695 g nyers alkaloid keveréket kapunk, melyet etanolban oldunk és pH-ját 4,2-re állitjuk be 3 *-os etanolos kénsavoldattal. A dimer alkaloidszulfátok tűkristályos alakjában azonnal kiválnak. A kristályosítást még 2 napig folytatjuk, majd a kristályokat centrifugálással elválasztjuk, etanollal mossuk és száritjuk. A maradék leurosin, vinkadiolin, vinblastin és vinkristin vegyes szulfátsóiból és kevés leurosin-szulfátból áll. A sókat a megfelelő szabad bázisokká alakitjuk át ugy, hogy a sókat vizben oldjuk, a vizes oldat pH-ját 8,0-ra állitjuk be 14 n ammónium-hidroxid-oldattal és a vizben oldhatatlan bázisokat metilén-kloriddal vonjuk ki. A metilén-klorid kivonatot szűrjük és az oldószert vákuumban lepároljuk. A maradékot 15 kg aluminium-oxidon /III-IV.aktivitás/ /2oo nf/g fajlagos felület/ kromatografáljuk, eluensként etil-aeetát/metilén-klorid/viz /25:75:o,4/ oldószerrendszert használva. A kromatografiát 5x73o cm-es rozsdamentes acéloszlopban 13,6-27,2 atm nyomáson hajtjuk végre. Az aluminium-oxid és az oszlopra felvitt alkaloidkeverék aránya körülbelül 3oo:l. Az eluátumot a 28o m/U-os ibolyántúli fényben megfigyelt csúcsok álapján választjuk szét. Vékonyrétegkromatográfiával túlnyomórészt leurosint, vinblastint, dez-N-metil-vinblastint és leurokristint tartalmazó frakció-2
