170134. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás vinblasztin-dez-n-metil-vinblasztin és vinkrisztin tisztítására

3 170134 4 A vinblasztin és leurozin frakciót benzol-éter elegyével eluálják. /Ez a módszer nem emliti a vinkrisztin kinyerési módját./ A jelen találmány tárgya eljárás vinkrisztin, dez-N-metil-vinblasztin és vinblasztin tisztítására, a Vinoa rosea levelekből. A találmány szerinti eljárás a kinyerni kivánt dimer alkaloidokat, elsősorban a leghatékonyabb vlnkrisztint, nagyobb tisztasági fokban eredményezi, mint bármelyik előbbiekben leirt eljárás, a vinkrisztin kitermelése nagyobb, vagy legalábbis azonos a hivatkozott eljárásokénál, és dez-N-metil-vinblasztint is eredményez, amely könnyen átalakítható vinkrisztinné. A találmány szerinti dimer indol alkaloidok tisztítására szolgáló eljárás az alábbi lépésekből áll. A Tinea rosea leveleket vagy a dimer alkaloidok egyéb természetes forrását vizes sav oldattal /pH=3 értéken/ extraháljuk, majd /l/ a kapott savas extraktum 5,8-6,5 értékre állitjuk, és a dimer alkaloidokat ismert módon valamely vizzel nem elegyedő szerves oldószerrel extraháljuk} /2/ a kapott extrahált dimer alkaloidokat ismert módon gél-kiszoritásos módszerrel kromatografáljuk; /3/ a kromatografált dimer alkaloidokat 1-3 szénatomszámu alkanolban oldjuk; /4/ kivánt esetben a nem oldódó alkaloidokat elkülönitjük az oldattól; /5/ a kapott alkanolban oldott alkaloidokat ismert módon szulfát sóikká alakitjuk, és a kivált alkaloid-szulfát sókat elkülönitjük; /6/ kivánt esetben az elkülönített szulfát sókat ismert módon szabad bázissá alakítjuk; 11I a kapott alkaloid-szulfát sókat vagy szabad bázisokat aluminiumoxidon nagy nyomáson kromatograf ál juk, előnyösen lo-3o kg/oof nyomáson; /8/ a tisztitott, elválasztott, a többi dimer vinka-alkaloidtól mentes vlnkrisztint, dez-H-metil-vinblasztint, illetve vinblasztlnt tartalmazó kromatográfiás frakciókat összegyűjtjük és a tiszta alkaloidokat ismert módon izoláljuk. A fentiekben leirt módszer szerint a növény - a Catharanthus roseus /Tinea rosea/ - leveleit, amelyek a nyers vinka-alkaloidokat tartalmazzák, 3-as pH értéken extraháljuk, kénsawal biztositva a kivánt savasságot. A vizes savas réteg extrahálására vizzel nem elegyedő oldószerként benzolt alkalmazunk, de használható toluol vagy egyéb hasonló oldószer is. Ezután a vizes savas extrakt pH-ját nátrium-hidroxiddal, ammónium-hidroxiddal vagy egyéb bázissal 6 körüli pH értékre állitjuk be és a dimer alkaloidokat szerves oldószerrel kiextraháljuk. Az ismételt extrakció oldószereként általában újra benzolt alkalmazunk, de egyéb vizzel nem elegyedő oldószer is használható. A gélkiszoritásos kromatográfiás lépésnél térhálósított dextran gélt alkalmazunk /Sephadex G-25 F/ oitrát pufferes rendszerben. A mozgó fázis 3,o-as pH értékű, o,l mólos ammónium-citrát puffer, de helyette más olyan puffer is alkalmazható, mely 3-as pH értékkel rendelkezik. A gélkiszoritásos kromatográfiás módszernél az alkalmazott nyomás l,o5 kg/etf körüli érték. A kromatográfiás eljárás során a dimer alkaloid frakció, mely vlnkrisztint, vinblasztint, des-N-metil-vinblasztint, leurozint és vinrozidint tartalmaz, eluálható elsőként. A dimer alkaloidok a 3-as pH-ju pufferböl kiextrahálhatók. oly módon, hogy a vizes oldat pH-ját 7-re állitjuk be ammónium-hidroxid hozzáadásával, majd a vizes 7-es pH-ju oldatot vizzel nem elegyedő oldószerrel, célszerűen ismét benzollal hozzuk össze. A benzol elpárologtatása után kapott maradék oldható etanolban és a leurozin ebből az oldatból közvetlenül kikristályositható. A leurozint dekantálással elkülönithetjük, ezután a megmaradt oldat pH-ját 4,2-re állitjuk be 3 ÍÉ-OS alkoholos kénsav oldat segítségével. Ily módon a megmaradt dimer alkaloido-A 2 kat szulfát-sóikká alakítjuk. A szulfát-sók elegyét tartalmazó csapadékból a szabad alkaloid bázisokat ismert módon állithatjuk elő, például oly módon, hogy a sókat vizben oldjuk és az oldat pH-ját ammónium-hidroxiddal pH 8,o-ra állitjuk be. g A dimer alkaloidokat vizzel nem elegyedő szerves oldószerrel, célszerűen metilén-dikloriddal kiextraháljuk. A metilén-diklorid elpárologtatása után nyert dimer alkaloidok elegyét nagy nyomáson kromatografáljuk aluminiumoxidon /III-as aktivitású/, eluáló folyadékként metil-acetát - me-10 tilén-diklorid - viz /48:51:1/ elegyét használjuk. Az alkalmazott nyomástartomány lo,5-26,o kg/enf közötti. Ismertek olyan berendezések is, amelyek 286--357 kg/crf, de még 536-572 kg/cnf közötti nyomástartományban is működtethetők. A nagy•ö nyomású kromatográfiás eljárásoknál rozsdamentes acél berendezéseket alkalmaznak, nyomásálló szerelvényekkel ellátva. A kromatográfiás eljárás során az alkaloidok a következő sorrendben eluálhatók: leurozin, vinblasztin, dez-N-metil-vinblasztin, 20 vinkrisztin és vinrozidin. Az elueiós frakciókban levő alkaloidok azonosítása a szakirodalomból ismert módszerekkel, például vékonyréteg kromatografiával történhet. A vinblasztint,dez-N-metil-vinblasztiht vagy vlnkrisztint tartalmazó frakciókat öszj. szegyüjtjük, majd vákuumban elpárologtatjuk ^3

az oldószert. A vinblasztint, a dez-N-metil-vinblasztint vagy a vlnkrisztint 4,2-es PH értéken a szulfát-sóvá alakithatjuk, alkoholos kénsav oldat hozzáadásával. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon mutatjuk be. 30 1. példa Tlnkrlsztin tisztítása Tiz kilogramm száraz Catharanthus roseus levelet három izben 1 óra hosszáig extrahálunk. Extraháló szerként 32 liter 5o C -os vizet használunk, amelynek pH-ját 3,o-ra állitottuk be 3o százalékos /s/f/ kénsav hoz-35 záadásával. A vizes extráitokat leöntjük a rostos anyagról, egyesitjük azokat, majd szűrjük. A szürletet két izben extraháljuk egyenlő mennyiségű benzollal és a benzolos extraktot eltávolítjuk. A szürlet pH-ját ezután 6,o-ra emeljük koncentrált ammónium._ -hidroxid hozzáadása révén. A vizes fázist 4U 6,o-os

pH értéken háromszor egyenlő mennyiségű benzollal extraháljuk. A benzolos extraktokat egyesitjük és vákuumban bepároljuk. Maradékként az 57 g nyers alkaloidot tartalmazó elegyet /TRA/ kapunk. 5 g ily módon előállított TRA-t feloldunk 45 25o ml 3,o-as pH-ju, o,l mólos ammónium-citrát pufferben, majd a 6oo gramm térhálósított dextrán gélen /Sephadex C-25 F/, 5xl4o cm-es üveg kolonnában, kromatografáljuk. A o,l mólos ammónium-citrát puffert /ph= =3,o/ mozgó fázisként használjuk. Az oszlop fej-nyomása l,o5 kg/erf, az átfolyási sebes-50 ség lo-14 ml/perc. A frakciókat összegyűjtjük és vékonyrétegkromatográfia segítségével /szilikagél, rendszer: dietiléter: toluol: metanol: dietilamin loo:5:5:5/ megállapítjuk, hogy melyik tartalmaz monomer-, melyik dimer alkaloidokat.Először a dimer alkaloidokat, a 55 vinblasztint, vinkrisztint, leurozint és a vinrozidint tartalmazó frakciókat kapjuk. Összegyűjtjük a vizes frakciókat, amelyek túlnyomórészt ezeket a dimer alkaloidokat tartalmazzák. \ pH-t ammónium-hidroxiddal 7,o-ra állitjuk be, majd az igy kapott semleges vizes oldatot háromszor extraháljuk térfogatához vi-60 szonyitva másfélszeres mennyiségű benzollal. A benzolos extraktokat összegyűjtjük és vízmentes nátrium-szulfáton megszűrjük. A szürletet vákuumban szárazra pároljuk, s ily módon l,o g dimer alkaloid elegyet kapunk. Ezt az elegyet 7,5 ml vízmentes etanolban felfiI_ oldjuk. 00 A leurozint ekkor kikristályositjuk és centrifugálással elkülönitjük. A kitermelés 157 mg leurozin.