170109. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és eszköz koleszterinoxidáz aktiválására, kimutatására és meghatározására

7 170109 8 g o-toluidinnel impregnáljuk, amely még a következő felületaktív anyagok l-l g-ját is tartalmazza: a/ Polioxi-etilén-tributil-fenoléter b/ Polioxi-etilén-szorbitán-monolaurát c/ Polioxi-etilén-nonil-fenoléter d/ Polioxi-etilén-lauril-éter e/ Polioxi-etilén-oetil-éter f/ Polioxi-etilén-sztearát g/ polioxi-etilén-dodecil-tioéter A száritás után kapott tesz-papirok koleszterintartalmú szérumokkal zöld szin-reakciót adnak. Ha a szérumok egyidejűleg koleszterinésztereket is tartalmaznak, erősebb zöld szin jelentkezik, ha a szérumhoz előzőleg egy csepp koleszterinészteráz-oldatot adtunk. Az olyan teszt-papir, amely az emiitett felületaktív anyagok egyikét sem tartalmazza, nem reagál a fenti szérumokkal. 5. példa Szurőpapirt /Schleicher-Schüll 597 NF.Ind./ a következő összetételű oldattal impregnálunk és 4o°C-on megszáritjuk: 1 M citrát-puffer pH 7 2o ml Koleszterinoxidáz /6o E/mg/ o,l g Koleszterinészteráz /18 E/mg/ o,25 g Peroxidáz /7o E/mg/ o,o5 g Desztillált viz loo ml A papirt száz ml metilén-kloridban oldott o,2 g ó-toluidinnel impregnáljuk, amely még a következő felületaktív anyagok o,5 g-ját is tartalmazza: a/ Polioxi-etilén-kokoát b/ Polioxi-etilén-oleát c/ Polioxi-etilén-polipropilénglikol d/ Polioxi-etilén-sztearil-amin e/ Polioxi-etilén-glicerin-monolaurát A száritás után kapott teszt-papirok zöld szinnel reagálnak az olyan szérumokkal, amelyek koleszterint és/vagy koleszterinésztereket tartalmaznak. Felületaktív szert nem tartalmazó teszt-papirok nem adnak reakciót. Gyakorlatilag ugyanígy viselkednek azok a teszt-papirok, amelyek azonos mennyiségű 5,25 illetve 6 pH-ju cltrát-puffert tartalmaznak. 6. példa A4, példa szerint előimpregnált papirt loo ml acetonban oldott o,3 g o-toluidinnal impregnálunk, amely még a következő felületaktív anyagok 1,5 g-ját is tartalmazza: a/ Dioktilnátrium-szulfo-szukcinát b/ Dodecil-benzolszulfonsav, nátriumsó c/ Lauril-poliglikoéter-szulfát, nátriumsó d/ Nátrium-lauril-szarkozinát e/ Nátrium-laurát f/ Kolsav g/ Dezoxikolsav h/ Nátrium-taurokolát Ezek a teszt-papirok gyakorlatilag ugyanolyan tulajdonságokkal rendelkeznek, mint a 4. példa szerint előállított papirok, de a reakcióban képződő szin hosszabb ideig stabil. Hasonlóan viselkednek a pH 7-es foszfátpuffert tartalmazó megfelelő teszt-papirok. 7. példa Az 5. példa szerint előimpregnált papirt még olyan oldatokkal impregnáljuk, amelyek o,4 g o-toluidint és a következő felületaktív anyagok o,5 g-ját tartalmazzák: a/ Lauril-pirldinium-klorid b/ Benzetónium-klorid c/ Cetil-trimetil-ammónium-klorid d/ l-Hidroxi-etil-l-karboxi-metil-2-alkil-imidazolinium-betain A teszt-papirok tulajdonságai megfelelnek az 5. példa szerint előállított papírokénak. 8. példa Szurőpapirt /Schleicher-Schüll 597 NT,Ind./ a következő összetételű oldattal impregnálunk és 4o°C-on szárltunk: 1 M foszfátpuffer, pH 6 25 ml Koleszterinoxidáz /6o E/mg/ o,l g Peroxidáz /7o E/mg/ o,o5 g Kolsav 1,0 g Aceton lo ml Desztillált viz loo ml-ig A papirt loo ml acetonban oldott oxidációs indikátorokkal utó impregnáljuk. , Az indikátorok mennyiségét, kémiai szerkezetét és a koleszterintartalmú szérumokkal adott szinreakcióját az 1. táblázatban foglaljuk össze: 1. táblázat 5 Mennyiség Indlkátor Szinreakció 10 15 20 o,3 g o-Vanillidén-p-vanilloil- ibolya -hidrazon o,2 g Azino-bisz-/N-etil-benzti- zöld azolon-2-szulfonsav-5/-diammóniumsó o,l g Azino-bisz-/N-alkil-kino- kékeslon-2-szulfonsav-6/-diam- ibolya móniumsó o,l g Bisz-/N-alkil-kinolon-2/- ibolya -az in o,l g /N-Metil-benztiazolon-2- kékes-/N-etil-kinolon-2/-azin zöld o,3 g /N-Metil-benztiazolon-2/- kék -l-fenil-3,4-dimetil-tiazolon-5-azin 9. példa A következő összetételű keveréket állitjuk elő: 45 g Polivinilpropionát-diszperzió Nátrium-ál gin át, 1,85 56-os, o,5 M foszfátpufferben, pH 5,5 35 g 25 Koleszterinoxidáz /60 E/mg/ o,5 g Peroxidáz /7o E/mg/ o,25 g Dioktil-nátrium-szulfo-szukcinát 1 g o-Toluidin, 6 ml acetonban oldva 0,6 g Viz 50 ml A keverékből nedvesen körülbelül 3oo nm vas-OQ tagságú filmet húzunk ki vagy szilárd hordozóra kikenünk és 35 C-on megszáritjuk. Ha koleszterintartalmú vért cseppentünk a filmre és 1 perc múlva a vért letöröljük, akkor a koleszterinkoncentrációtól függően különböző erősségű zöld szineződést kapunk. Ha a fenti recepturához még l,o g koleszte-35 rinészterázt is adunk, ugy olyan filmeket kapunk, amelyekkel magas koleszterintartalom is meghatározható. 40 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás koleszterinoxidáz aktiválására, azzal jellemezve, hogy a koleszterinoxidázhoz felhasználás előtt legalább egy, li. pofii- és hidrofil tulajdonságokkal rendelke-43 ző, előnyösen legalább egy hidroxilcsoportot tartalmazó felületaktiv vegyületet vagy ezek polioxietilén-származékait, előnyösen a hidroxi-polietoxi-dodekánt adjuk, emellett ezek menynyisége o,oo5 és 0,6 suly# közötti a vizes enzimoldatra vonatkoztatva vagy adott esetben 50 legalább egy felületaktiv kisszénatomszámu mono- vagy dlalkoholt, előnyösen etanolt vagy butil-diglikolt adunk, melyek mennyisége lo és 2o térfogatszázalék közötti a vizes enzimoldatra vonatkoztatva. /Elsőbbsége: 1973. december 1.1 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás fogana-55 tositásl módja, azzal jellemezve, hogy felületaktiv anyagként alkil-, aril- és aralkil-alkoholok polioxi-etilén-származékait használjuk. /Elsőbbsége: 1973. december 7./ 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemez-50 v e, hogy a felületaktiv vegyületet a vizes enzimoldatra vonatkoztatva o,oo5-o,l suly# mennyiségben használjuk. /Elsőbbsége: 1973. december 7./ 4. Diagnosztikai eszköz testnedvek koleszterin- és koleszterin-észter-tartalmának kimutatására és meghatározására, a koleszterinnek 65 oxigénnel, koleszterinoxidáz jelenlétében kolesztenonná és hidrogén-peroxiddá történő oxidálásával és a hidrogén-peroxid valamely oxi-4