170109. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és eszköz koleszterinoxidáz aktiválására, kimutatására és meghatározására

170109 lioxi-etilén-származékai és hasonlók. Merkaptánokkal módosított polioxi-etilén-származékok is alkalmasnak bizonyultak. Az emiitett, különösen előnyben részesitett osztályba tartozó felületaktív vegyületeket általában o,oo5-o,l súly* mennyiségben teljesen elegendő az enzimhez hozzáadni. E vegyületcsoportnak egész sora van többnyire kereskedelmi forgalomban, amelyek egymástól az oxi-etilén-csoportok számában különböznek. Leghasznosabbak azok a vizoldható vegyületek, amelyek közepes mennyiségű oxi-etilén-csoportot tartalmaznak /körülbelül 5-2o/. A kevesebb oxi-etilén-csoportot tartalmazó fajták többnyire csak diszpergálhatók és emiatt kevésbbé használhatók. A több oxi-etilén-csoporto-t /25-nél több/ tartalmazó tipusok vizoldhatók ugyan, de annyira hidrofilek, hogy hatékonyságuk_csökken. Hasonló eredmények érhetők el a fenti meghatározásnak megfelelő fiziológiás felületaktív anyagokkal is, például dezoxikolátokkal. Ezek mellett egyéb olyan mind lipofil mind hidrofil tulajdonságú felületaktív anyagok is alkalmasnak bizonyultak, melyek legalább egy hidroxilcsoportot tartalmaznak, mint például etanol, butil-diglikol és hexilén-gllkol. Az ilyen kisszénatomszámu mono- vagy dialkoholokat azonban viszonylag nagy, lo-2o térfogat*ban kell alkalmazni a kivánt aktiválás eléréséhez, és alkalmasságukat mindig kísérletesen kell megállapítani. Nincs aktiváló hatása például a metanolnak, etilénglikolnak, polietilénglikolnak, ciklohexanolnak, glicerinnek, lecitinnek, szaponinnak. Alkalmasak az olyan felületaktív szerek is, amelyek mind lipofil, mind hidrofil tulajdonságokkal rendelkeznek ugyan, de nem tartalmaznak hidroxilcsoportot. Az anionos nedvesitőszerek közül különösen az epesavas sók, mint kolsav, taurokolsav és dezoxikolsav használhatók, továbbá zsirsavas sót és zsirsav-szarkozídok. Különösen jelentősek a kénsavszármazékok, melyeknek - mint ismeretes - még az a tulajdonságuk is megvan, hogy egyes indikátorok /otöluidin, heterociklusos azinok/ szines oxidációs termékeit stabilizálják. Ilyenek például a következő osztályok: szulfo-borostyánkősavészterek, alkil-aril-szulfonátok, alkilszulfátok, alkil-polioxi-etilén-szulfátok. A kationos nedvesitőszerek közül például az alkil-piridinium- vagy -trimetil-ammóniumsők használhatók, de alkalmasak olyan bonyolult felépitési vegyületek is, mint például a benzetónium-klorid /femerol-klorid, p-/l,l,3,3-tetrametil-butil/-beta-fenoxi-etoxi-etil-dimetil-benzil-ammónium-klorid/. Az amfoter nedvesitőszerek közül például az imidazólium-betalnok használhatók. Különleges példa a nátrium-di-/2-etil-hexil/-szulfo-szukcinát, nátrium-dodecil-szulfát, nátrium-oleát, benzalkónium-klorid és cetil-piridinium-klorid. Előnyösen az ilyen ionos vagy amfoter detergenseket a fent emiitett nem-ionos detergensekkel kombinálva használjuk. Az alkalmazandó mennyiségek megfelelnek a nem-ionos detergensek mennyiségének. A nem-ionos, legalább egy hidroxilcsoportot tartalmazó felületaktív detergenseket azért részesítjük előnyben, mert mintegy 5-lo-szer erősebb aktiválást és ezzel együtt megfelelően nagyobb reakciósebességet, illetve rövidebb reakcióidőt biztosítanak, mint az egyéb használható felületaktív anyagok, azonfelül kis mennyiségekben is hatásosak. Alkilcsoportok alatt itt legfeljebb 2o, különösen a 12-18 ezénatomszámuakat értjük. A koleszterinoxidáz detergensnyomok hatására bekövetkező inaktiválódása különösen akkor lép előtérbe, ha az enzim ammónlum-szulfát-oldatban van feloldva. Az alábbi táblázatban különböző detergensmennyiségeknek Ili ammónium-szulfát-oldatban levő enzim tárolási stabilitására gyakorolt hatását tüntetjük fel /33 C-on/. A kísérleteket oktil-fenol-etilén-oxidadduktumon végeztük el. . Koleszterinoxidáz aktivitása ^-ban, frissen elöallitott enzim aktivitasára vonatko

ztatva Napok száma Detergens nélkül o,o2^ o,o5% o,l# 0,6$ lo 89* 60$ lo* 7* 5* 22 85* 48* 1* 1* 1* A találmány szerint az enzimhez hozzáadott 1f, felületaktív vegyület hatásos mennyisége függ az illető vegyület molekulasúlyától és hidrofób és hidrofil tulajdonságainak mértékétől. Túlságosan kis mennyiségnek nincs aktiváló hatása, tul nagy mennyiség pedig a felületaktív anyagok általánosan ismert enzimdenaturáló hatásához vezet. A megfelelő koncentrációtarto-15 mányt, valamint az optimális koncentrációkat minden alkalmas felületaktív szer esetében kísérletesen kell megállapítani. Hidroxi-polietoxi-dódekárira például az alkalmas tartomány o,15-o,6 s*, oktil-fenol-etilén-oxid-adduktumokra o,o3-o,l s*, szorbitán-hidridek polioxiop. -etilén-származékaira o,15-o,6 s*, nátrium-dezoxikolátra o,o3-o,o5 s*, merkaptánnal módositott alkil-fenoletilén-oxid-adduktumra /például Sterox SE/ o,oo5-o,o2 s*. A nem-ionogén felületaktív polioxi-etilén-vegyületek közül különösen azok használhatók, amelyekben a hidrofób rész és a poli-25 oxi-etilén-lánc aránya egyensúlyban van és vizben oldódnak. A hidrofób rész és a polioxi-etilén-lánc azaz a hidrofil rész arányának mértéke az úgynevezett HLB-érték /lásd W.C.Griff in, J.Soc. Cosmetic.Chem. 1, 311 /195o/ és 5, 249 /1954/. on Különösen hasznosak a lo-17 HlTB értékű fe•iu

lületaktiv anyagok, Ezek az értékek mindenesetre csak irányértékeknek tekinthetők, mivel a hatásosság a hidrofób rész természetétől is függ. A találmány tárgyát továbbá koleszterin és koleszterinészterek szövetnedvekben való kimu-35 tatására és meghatározására szolgáló diagnosztikai eszköz képezi. A koleszterin meghatározása igen jelentős az orvosi diagnosztikában. A klinikai kémiában ujabban egyre több gyorspróbára van szükség a testfolyadékok anyagainak kimutatása céljából. Ezek a próbák gyakran nem 40 adnak egészen pontos eredményeket, mégis a rutin- és sorozatvizsgálatokhoz gyorsaságuknál fogva értékes segitséget nyújtanak. A gyorspróbához használt diagnosztikai eszközök szivóképes hordozók vagy vizálló filmek, amelyek a reakcióhoz szükséges valamennyi vegyületet tar.{• talmazzák. Ezeket a diagnosztikai eszközöket a vizsgálandó testfolyadékokkal érintkeztetve szinreakciókat kapunk, amelyek szinösszehasonlitás alapján, vagy fotometrikusan értékelhetők. Azok a próbálkozások, amelyek szivóképes papír koleszterinoxidázzal, peroxidázzal, oxidá-50 ciós indikátorral és pufférrel való impregnálásával koleszterin-gyorspróbához alkalmas eszköz előállítására irányultak, nem vezettek eredményre, mivel a kapott teszt-papirok nem reagáltak szokásos koleszterinkoncentrációju szérumokkal . P-j- , Azt találtuk, hogy használható teszt-papirok •3Ü

vagy teszt-filmek nyerhetők, ha a hordozó Impsegnálására szolgáló reagensekhez még a leirt felületaktív szert is hozzáadjuk. Testnedvek koleszterin- és koleszterinészter-tartalmának meghatározására szolgáló, találmány szerinti diagnosztikai eszköz igy hor-60 dozóból vagy müanyagfilmből áll, amelyet koleszterinoxidázzal, hidrogén-peroxid kimutatására szolgáló rendszerrel, pufferrel és a leirt felületaktív vegyülettel impregnálunk, vagy amely az utóbbi anyagokat beágyazva tartalmazza. A felületáktiv szer koncentrációja „,. célszerűen a szilárd reagensek 2-3o, előnyö-00 sen lo-2o *-a. A hidrogén-peroxid kimutatására előnyben részesitett rendszer peroxidázt és oxidációs <