170053. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a mikroba-eredetű tejalvasztó enzim fermentációs úton történő előállítására
3 170053 4 készítmény előállítása esetén betöményítés után a koncentrátumot frakcionáljuk, szűrjük és az enzimet alkohollal kicsapjuk vagy porlasztva szárítjuk. Állandó törzsállomány esetében a jó hatékonyságú törzseket merevített, malátás agárra oltjuk le. Három hetes 28 C°-on való inkubálás után a felületre steril paraffin-olajat töltünk a papírvattadugótól körülbelül 1 cm magasságig. A törzseket a továbbiakban szobahőmérsékleten tároljuk. Ezzel a módszerrel 2-3 évig eltarthatok a törzsek hatékonyság-csökkenés nélkül. Az inokulumhoz szükséges törzsállományt merevített, 3-20%-os, előnyösen 5%-os malátás agárra oltjuk le. A felületről már 4-hetes 28C°-os inkubálás után a spóratöineg inokulum oltásához felhasználható és minősége 4—6 hónapos korig nem csökken. Az inokulum készítést maximálisan 2 lépcsőben úgy végezzük, hogy a fenti módon csíráztatott malátás agar felületéről nagyszámú spórát mosunk le (108|ml), ezt inokulum-táptalajba oltjuk, 24—48 órán át tenyésztjük, majd nagyobb mennyiségű táptalaj esetén ezt tovább oltjuk és 18-36 órán át fermentáljuk. így a termelő táptalaj beoltására alkalmas inokulumot kapunk. Az inokulum-táptalaj összetétele az alábbi: 3 -7% dextróz, burgonyacukor vagy szacharóz, 2 -6% szója- vagy mogyoróliszt, 0,2-1,0% KH2 P0 4 , 0,2-0,6% étolaj, pH = 6,0 (önbeálló) A termelő táptalaj összetétele az alábbi: 1 -5% extrahált szójaliszt, 3 -7% dextróz, burgonyacukor vagy szacharóz, 0,3-1,5% CaC03 , Mg1S0 4 vagy KH 2 P0 4 0,2-0,6% étolaj. A táptalaj induló pH-értéke 6,0, a fermentáció 4,0 - 4,5 pH-értéken fejeződik be. Ez azért előnyös, mert az Endothia parasitica által termelt enzim itt a legstabilabb. Tapasztalataink szerint az enzim itt csapható ki legkönnyebben, ami a por-alakú preparátum készítésénél nem elhanyagolható szempont. így tehát, hogy a fermentáció 4,5 pH-értéken fejeződik be, utólagos pH-beállítás nem szükséges. A sóadalékként alkalmazott CaC03, MgS04 vagy KH 2 P0 4 több szempontból előnyös. Egyrészt növeli az aktivitást, másrészt biztosítja azt, hogy a fermentáció folyamán a pH-érték ne csökkenjen 4 alá, mert az a penésztörzs fejlődése szempontjából káros lenne. A találmány szerinti eljárás alkalmazásával lehetővé vált, hogy a fermentlé aktivitását az addigi 200 SE/ml aktivitásról 500 SE/ml-re növeljük. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint a termelő táptalajhoz Ca(N03 ) 2 -t is adagolunk, amely a fermentlé aktivitását tovább növeli. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példát adjuk meg. Példa A 00126 MNG szám alatt letétbe helyezett Endothia parasitica törzset 500 ml-es Erlenmeyer 5 lombikba merevített 5%-os malátás agárra oltjuk le. A leoltásnál nem szélesztjük a spóratömeget, hanem kaccsal az agar felületére beszúrjuk a spórákat. így a gomba növekedése az agar közepétől indul és spóratermelés mellett benövi a rendel-10 kezesre álló felületet. A felületről a spóratömeg már 4-hetes, 28 C° -on végzett • inkubálás után felhasználható inokulum oltáshoz. Az inokulum készítéséhez az alábbi táptalajt használjuk: 15 5% dextróz, 3% szójaliszt (natúr), 0,4% KH2 P0 4 , 0,3% étolaj. 20 A táptalaj pH értéke 6,0. 100 ml inokulum táptalajt 500 ml-es Erlenmeyer lombikokban sterilezünk. A lombikokat a fenti 25 módon spóráztatott agar felületéről lemosott spóraszuszpenzióval úgy oltjuk, hogy a táptalaj lombikonként 5-5 ml spóraszuszpenziót (108 spóra/ml) tartalmazzon. A spóraszuszpenzió spóratartalmát minden eset-30 ben meghatározzuk. Ehhez olyan spóraszuszpenzióra van szükségünk, amelyben a spórák elkülönülten állnak és összecsapódás nincs. Ennek elérésére a spóra szuszpendálásához Tween 80 0,1%-os oldatát használjuk fel. Ennek a sterilezett folyadék-35 nak 50 ml-ét öntjük az agar felületére, steril üveggyöngyöt szórunk belé és 10-20 percre síkkör rázógépre tesszük. Teljesen homogén szuszpenziót nyerünk. A spóraszámlálást Bürker kamrában végezzük a 40 vérsejt számlálásnál alkalmazott módszer szerint. A szuszpenziót akkor tartjuk jónak, amikor ml-ként 108 -on nagyságrendű spóratömeget tartalmaz. A tenyésztést síkkor rázógépen végezzük (300 fordulat/perc) 28 C°-on, 36 órán át. Sűrű 45 micélium-tenyészetet kapunk. Amennyiben nagyobb mennyiségű táptalajt kellett beoltanunk, az inokulumkészítés során egy második generációt is leoltottunk. A táptalaj és az alkalmazott lombikok a már leírtak voltak. Te-50 nyésztési feltételek is azonosak voltak, kivéve hogy ezt a második generációt 24 órán át rázattuk („KI" inokulum). Lombikjainkat 5% mennyiségű inokulummal oltottuk. Annyi lombikot oltottunk le, amennyi a nagyobb, oltandó táptalaj 5%-ának 55 felel meg. A kapott inokulummal az alábbi módon valósítjuk meg a fermentációt: Termelő táptalaj: 60 2,0% extrahált szójaliszt, 3% dextróz, 0,5% CaC03 , 0,5% étolaj. Az induló pH-érték 6,0 — 6,4 (önbeálló), a táptalaj 65 refrakciója: 4,5%. 2
