170025. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromycin B antibiotikum és egy új hidrolitikus hatású enzim, valamint ilyen enzimet tartalmazó enzimkészítmények előállítására

13 170025 14 A fentiekben említett eluálást 4C°-on végezzük, majd az aktív frakciókat elkülönítjük és liofilizáljuk. így 800 mg készítményt kapunk, amelynek aktivitása 25 PE/mg és fajlagos aktivitása 65 PE/mg fehérje. A kapott 800 mg-nyi anyagot feloldjuk 8 ml 0,001 mólos kalcium-klorid-oldatban, majd az így kapott oldatot sómentesítjük úgy, hogy Sephadex G-l5 márkanevű anyaggal töltött oszlopra (átmérője 2,5 cm, a Sephadex-töltet magassága 42 cm) fel visszük. dőhöz protohygrolytint adunk, majd a mészmentesítést és a cserzést a berendezés folyamatos forgása közben 32—34 C° hőmérsékleten végezzük. Az utóbbi műveletek paraméterei az alábbiak: 5 1.) Mészmentesítés: időtartama 15-20 perc, ammónium-szulfát felhasználása a tisztított borjúbőr súlyára vonatkoztatva 1,5-2,0 súly%. 2.) Cserzés: időtartama 15-20 perc, a tisztított 10 borjúbőr súlyára vonatkoztatva 80 PE aktivitású protohygrolytin felhasználása 0,05-01 súly%. Az aktív frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. így 120 mg tiszta enzimet kapunk, amelynek ak- 15 tivitása 56 PE/mg és fajlagos aktivitása 60 PE/mg fehérje. 6. példa 20 Nyers szarvasmarhabőrt annak alkálifénisókat vagy enzimoldatokat nem tartalmazó vízzel végzett mosása után literenként legalább 900 PE aktivitású vizes protohygrolytin-oldattal kezelünk 24 órán át 25 20-25 C°-on. Ezután a nyersbőrt szőrtelenítő berendezésen szőrtelenítjük. 7. példa 30 Nyers szarvasmarhabőrt mosás és lágyítás után préselünk, majd barkaoldalára négyzetdeciméterenként 55-70 PE dózisban enzimkészítményt (protohygrolytint) tartalmazó vizes oldatot viszünk fel. 35 Ezután á" nyersbőröket kisebb halmokba rakjuk úgy, hogy az egyik bőr barkaoldala a másik barkaoldalához érintkezzék, majd 24 órán át állni hagyjuk. Ezt követően a bőröket szőrtelenítő béren dezésen szőrtelenítjük. 40 8. példa Nyers borjúbó'rt, kecskebőrt és báránybőrt víz- 45 ben végzett mosás és puhítás után húsolunk, majd a bőrök húsoldalára négyzetdeciméterenként 65-70 PE dózisban az enzimkészítmény vizes oldatát visszük fel. Ezután a bőröket kisebb halmokba rakjuk úgy, hogy az egyik bőr húsoldala a másik 50 bőr húsoldalához érintkezzék, majd 16-24 órán át állni hagyjuk, vagy ugyanilyen időtartamra felfüggesztjük. Ezt követően a bőröket szőrtelenítjük. 55 9. példa 60 Hagyományos módon végzett puhítás és neszezés után borjúbőröket folyó vízben mozgó berendezésben 40-60 percen át mossuk, amikor is a mosás végére a hőmérsékletet 34C°-ra emeljük. A folyadékkoefficiens értéke 1,-1,5-2,5-3,5 között van. A mészmentesítés és a cserzés ugyanezen a berendezésen történik. Ammónium-szulfát beadagolás után 10—20 perccel a mészmentesítő für- °5 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás a Hygromycin B antibiotikum és egy új, hidrolitikus hatású enzim együttes előállítására, amely mintegy 37 000 molekulasúlyú semleges proteáz, izoelektromos pontja pH 8,8, hatását optimálisan 40-45 C°-on fejti ki és vizes oldatokban pH 6,8 és 8,0 között stabil, valamint vizes oldatokban 50 C° feletti hőmérsékleten inaktiválódik, azzal jellemezve, hogy Actinomyces hygroscopicus VNIIA-997 törzset vagy e törzs 200 000 röntgen dózisú röntgensugárzás hatására képződő variánsát 200-400 mg% össznitrogént, 40-160 mg% ammónia formájában kötött nitrogént, 7-27 mg% szervetlen foszfort, 1—2,5% szervetlen foszfort, 1-2,5% lipidet, valamint 0,8-1,5% redukálószert, célszerűen glükózt tartalmazó táptalajon aerób süllyesztett tenyésztési eljárásban tenyésztjük, a folyékony tenyészetben a hidrolitikus hatású enzimet a törzs anyagcseretermékei mellett feldúsítjuk, adott esetben a képződött Hygromycin B antibiotikumot célszerűen kationcserélővel végzett kezelés útján elkülönítjük, majd az enzimet elkülönítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 1-1,5 súly% szójalisztet, 0,2-0,3 súly% kukoricakivonatot, 1-2,5 súly% mennyiségben ámbrás cet zsírját, 0,88-1,5 súly% glükózt, 0,2-0,8 súly% ammónium-szulfátot, legfeljebb 0,5 súly% nátrium-kloridot, 0,3-0,8 súly% kalcium-karbonátot, valamint 0,8-1,6 súly% vízmentes takarmányélesztőt - fehérje-vitamin-komplexet - tartalmazó táptalajon végezzük. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az enzim elkülönítését az enzimet termelő törzs biomasszájának a folyékony tenyészettől való elkülönítése, a kapott oldatból az enzimnek az oldat térfogatára vonatkoztatva 50-60%-ban vett ammónium-szulfáttal végzett kicsapása, a kapott csapadéknak acetonból végzett átcsapása, az így kapott csapadéknak kalcium-klorid-oldatban végzett feloldása, a kapott oldat aktív szénnel végzett derítése, majd az oldat sterilizálása és liofilizálása útján végezzük. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a liofilizált enzimet 0,001 mólos kalcium-klorid-oldatban feloldjuk, a kapott oldatot gélszorpciós anyaggal töltött oszlopon keresztülbocsátjuk, majd a kapott oldatot liofilizáljuk. 7