170025. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromycin B antibiotikum és egy új hidrolitikus hatású enzim, valamint ilyen enzimet tartalmazó enzimkészítmények előállítására

170025 3 4 daságban takarmánytápok fehérjekomponenseinek hidrolizálására annak érdekében, hogy azok könnyebben asszimilálhatok legyenek. Felhasználható továbbá az élelmiszeriparban (pékségekben, serfőzdékben, húsiparban a hús puhítására, .halfeldolgozóiparban), a mikrobiológiai iparban táptalajok előállításánál fehérjekomponensek, különösen élesztő hidrolizálására, fényképészeti anyagokat előállító üzemekben a termelésnél képződő hulladékanyagokból a zselatinhoz kötött ezüst utólagos extrahálásárá, valamint a bőrfeldolgozásnál nyersbőrök szőrtelenítésére és cserzésére. A hygrolytin proteolitikus hatású és így légzőszervi megbetegedések, gennyes kelések és égési sebek kezelésére, valamint pleuraempyeman kezelésére és megelőzésére hasznosítható, minthogy elfolyósítja a sűrűnfolyó és viszkózus exsudátumokat. A hygrolytin felhasználható továbbá trombolitikus és trombusképződést megelőző készítményként, adott esetben antikoagulánsokkal kombinálva. A nyers enzimkészítmény hidrolitikus hatású enzimet (azaz hygrolytint) tartalmaz 50-500 PE/g (Kunitz-féle proteolitikus egység) mennyiségben, továbbá a készítmény az enzimet termelő, alábbiakban említett Actinomyces hygroscopicus törzsek valamelyikének anyagcseretermékeit is tartalmazza. Az említett nyers enzimkészítmény barna por alakjában kapható. A találmány szerinti eljárás abban áll, hogy Actinomyces hygroscopicus törzset [deponálva 997 szám alatt a moszkvai Összszövetségi Antibiotikum Kutató Intézet (továbbiakban eredeti orosz rövidítéssel VNIIA) törzsgyűjteményében] vagy 200 000 Röntgen dózisú röntgensugárzás hatására képződő variánsát 200-400 mg% össznitrogént, 40-160 mg% ammónia formájában kötött nitrogént, 7-27 mg% szervetlen foszfort, 1-2,5% lipidet, valamint 0,8-1,5% redukálószert, célszerűen glükózt tartalmazó táptalajokon aerob süllyeszti' tenyésztési eljárásban tenyésztjük, amikor is a tenyészetben az említett törzsek anyagcseretermékei mellett a hygrolytint feldúsítjuk, majd elkülönítjük. A fermentálásnál két vagy több proteáz képződhet, amelyek a hatásos hygrolytint alkotják. A fermentáláshoz táptalajként célszerűn 1—1,5 súly% szójalisztet, 0,2—0,3 súly% kukoricakivonatot, 1-2,5 súly% mennyiségben ámbrás cet zsírját, 0,8-1,5 súly% glükózt, 0,2-0,8 súly% ammónium-szulfátot, legfeljebb 0,5 súlyf nátrium-kloridot, 0,3-0,8 súly% kalcium-karbonátot és 0,8-1,6 súly% takarmányélesztőt (fehérje-vitaniin-komplex) tartalmazó táptalajt használunk. A végtermék elkülönítését célszerűen úgy végezzük, hogy a hygrolytint termelő törzs biomasszájától elválasztjuk a tenyészet folyékony részét, majd az így kapott oldatból az enzimet az oldat térfogatára vonatkoztatva 50—60% mennyiségben vett ammónium-szulfáttal kicsapjuk, a kapott csapadékot acetonból átcsapjuk, az ekkor kapott csapadékot kalcium-klorid oldatában feloldjuk a kapott oldatot aktív szénnel derítjük, majd sterilizáljuk és liofil szárításnak vetjük alá gyógyszerként felhasználható enzimkészítmény előállítása céljából. A hidrolitikus hatású tiszta enzim előállítására a liofilizált port 0,001 mólos kalcium-klorid-oldatban feloldjuk, a kapott oldatot gélkonzisztenciájú szorbensekkel töltött oszlopon átbocsátjuk, majd liofil 5 szárításnak vetjük alá. A végtermék elkülönítése végezhető a tenyészet betöményítése, és a kapott enzimkészítmény megszárítása útján is. A végtermék elkülönítése történhet továbbá úgy 10 is, hogy az enzimet termelő törzs biomasszájától a tenyészet folyékony részét elválasztjuk, majd a kapott oldatot betöményítjük és megszárítjuk. Mint említettük, hygrolytint termelő törzsként 15 az Actinomyces hygroscopicus VNIIA-997 törzset alkalmazhatjuk. Ez a törzs előnyös módon az enzim mellett a Hygromyzin B nevű antibiotikumot is termeli, amely a táptalajban feldúsul és úgy különíthető el, hogy a végtermék, azaz az enzim 20 elkülönítése előtt a tenyészetet karboxilcsoportokat hordozó kationcserélőn bocsátjuk keresztül. Ez esetben lehetséges, hogy a Hygromycin B antibiotikum elválasztása előtt a tenyészetből az Actinomyces hygroscopicus VNIIA-997 biomasszáját 25 elkülönítjük. Az Actinomyces hygroscopicus VNIIA—997 mikroorganizmus keményítőt. tartalmazó szintetikus Czapek-féle táptalajon - amely 1 g kálium-hidrogén-foszfátot, 3g nátrium-nitrátot, 0,5 g kálium-30 -kloridot, 0,5 g magnézium-szulfátot, 0,015 g vas(Il)-szulfátot, 20 g keményítőt, 25 g agar-agart és egy liter vizet tartalmaz — (a táptalaj sterilizálását 0,8 at nyomáson 30 percen át végezzük, a sterilizálás után a pH értéke 7,0—7,1) szorosan összenyo-35 mott, spirálformájú spóratagokat képez 1 — 3 hajlattal a spirálban. A spórák szegmensein szemölcsszerű képződmények láthatók. A légmicélium mind szintetikus, mind szerves eredetű táptalajon jól kifejlett. A micélium nem fragmentált, a szkleróták 40 hiányoznak. Ásványi sókat, valamint glükózt tartalmazó Czapek-féle táptalajon a spórákat képző légmicéliumok színe szürkésfehér és szürke között változik. 3g kálium-hidrogén-foszfátot, 0,3 g magnézium-45 -karbonátot, 0,2 g nátrium-kloridot, 1,0 g kálium-nitrátot, 0,001 g vas(II)-szulfátot, 0,5 g kalcium-karbonátot, 20 g szacharózt, 15 g agar-agart és 1 liter vizet tartalmazó, szintetikus Krassilnikowféle táptalajon (a sterilizálás 110C°-on 20 percen 50 át tart, a táptalaj pH-értéke a sterilizálás után 7,0) a törzs jól nő, amikor is 4—6 mm átmérőjű, domború telepek képződnek. A légmicélium kis mértékben képez spórákat, színe szürkésfehér. A szubsztrátmicélium sárgásbarna. 55 Keményítőt tartalmazó Czapek-féle táptalajon a telepek átmérője 4-6 mm, színűk fehér, alakjuk lapos, asporogén jellegűek, a szubsztTátmicélium gyengén homokszínű. 10 g oldható keményítőt, 1 g vízmentes kálium-60 -hidrogén-foszfátot, 1 g magnézium-szulfát-heptahidrátot, lg nátrium-kloridot, 2g ammónium-szulfátot, 2g kalcium-karbonátot, 1 liter vizet és 20 g agar-agart tartalmazó keményítő-ammónia-táptalajon (sterilizálása 0,5 at nyomáson 30 percen át tart, a 65 sterilizálás után a pH-értéke 7,0-7,2) a telepek 2