169942. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-amino-3-htt metilcef-3-ém-4-karbonsavak mikrobiológiai előállítására

5 169942 6 Hogy a. II általános képletű vegyületek I általános képletű vegyületekké való átalakításának hatékonyságát fokozzuk (ezt a hatékonyságot a következőkben „N-dezacilező hatékonyság"-nak nevezzük), a baktériumokat előnyösen mutációt elő- 5 idéző módon, például ultraibolya sugárzással, röntgensugárzással vagy mutagen szerrel kezelhetjük. Az N-dezacilező hatású mikroorganizmus segítségével az I általános képletű vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy a mikroorganizmust tenyésztjük, 10 és a II általános képletű vegyületet a mikroorganizmus tenyészetével vagy az ebből ismert módon nyert készítménnyel kezeljük. A mikroorganizmus célszerűen aerób körülmények között, még előnyösebben süllyesztett 15 aerób körülmények között tenyésztjük. A táptalaj asszimilálható szénforrást, asszimilálható nitrogénforrást és sókat tartalmaz. A tenyésztés hőmérséklete előnyösen 25—37 C és időtartama általában 2—10 nap lehet, és a tenyésztést természetesen 20 abban az időpontban kell befejezni, amikor az N-acilező hatás maximális. Az így kapott mikroorganizmus-tenyészetet vagy az ebből nyert készítményt a II általános képletű vegyület N-dezacilezésére használhatjuk. A mikro- 25 organizmus tenyészetéből készítmény kinyerése annyit jelent, hogy az I általános képletű vegyület előnyös kitermelése érdekében fokozzuk a tenyésztömeg N-dezacilező hatékonyságát, és az N-dezacilező hatékonyság endoenzimes tulajdonsága 30 miatt a tenyésztömegből elválasztott mikroorganizmus sejteket mossuk, az őrölt vagy ultrahanggal kezelt roncsolt sejtekből sejtmentes kivonatot készítünk, a kivonathoz pufferoldatot vagy cetilpiridiniumkloridot adunk, és a sejtmentes kivonatból 35 kapott N-dezacilező enzimet ismert módszerekkel, például kisózással, kromatografálással stb. tisztítjuk, vagy részlegesen tisztítjuk, és az enzimkészítményt vagy a mikroorganizmus-sejteket vagy ezek N-dezacilező hatékonyságú készítményét tartalmazó mik- 40 rokapszulákat kialakítjuk. A mikrokapszula előnyösen háromdimenziós szerkezet (gélszerkezet) lehet, és olyan félig áteresztő polimerhártyából áll, amely az N-dezacilező aktivitást nem hatástalanítja^ és falként veszi körül 45 az N-dezacilező hatékonyságú készítményből álló magot. A kapszulázási művelet többféle lehet, ilyen például az a módszer, amikor a hatóanyag vízzel elegyedő oldószerben van oldva vagy diszpergálva, 50 és a félig áteresztő hártyát képező polimer vizes közegben oldható (49-25128 számú japán nyilvánosságra hozatali irat), ekkor a falat alkotó polimert a víznél alacsonyabb forráspontú és nagyobb gőznyomású vízzel hem elegyedő oldó- 55 szerben oldjuk, amely az N-dezacilező aktivitást nem hatástalanítja, ezután a hatóanyagot diszpergáljuk benne, és ezt a diszperziót egy felületaktív anyagot vagy védőkolloidot tartalmazó vizes oldatba csepegtetve szuszpendáljuk, majd az oldószer 60 eltávolításával kialakítjuk a mikrokapszulát (47—43803 számú japán szabadalmi leírás, 49—49679 számú japán nyilvánosságra hozatali irat), egy másik módszer a nemoldószeres emulgálás által oldószert eltávoító mikrokapszula-előállítás, például 65 oly módon,; hogy a hatóanyagot szerves oldószerben oldjuk, a fal-polimert is feloldjuk benne, ezt az oldatot olyan vivőanyagban szuszpendáljuk, amely az említett fal-polimer oldószerével csak kevéssé elegyedik, a kapott emulzióhoz a fal-polimert nem oldó olyan oldószert adunk, amely a fal-polimer oldószerével elegyedik, de a vivoanyaggal kevéssé vagy gyengén elegyedik, és az N-dezacilező aktivitást hatástalanítja, és a mikrokapszulákat ezáltal alakítjuk ki (2 166 062 számú francia szabadalmi leírás). Ilyen még a komplex emulziós módszer lipofil vivőanyagban, ezt például úgy hajtjuk végre, hogy a fal-polimert olyan oldószerben oldjuk, amely a vivőanyaggal kevéssé elegyedik, de vízzel elegyedik, forráspontja alacsonyabb a vizénél, és az N-dezacilező képességét hatástalanítja. Ebben az oldatban a hatóanyagot oldjuk vagy diszpergáljuk, az így keletkezett oldatot cseppfolyós paraffin vagy szilikonolaj vivőanyagban emulgáljuk-diszpergáljuk, és a szerves oldószert eltávolítva kialakítjuk a mikrokapszulákat (3 714 065 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A II általános képletű vegyület N-dezacilezését általában folyékony táptalajban, előnyösen 6—8 pH-n végezzük. Ugy is eljárhatunk, hogy a vízben oldhatatlan mikroorganizmus sejteket vagy az ezekből kapott készítményt szuszpenzió alakjában használjuk, vagy oszlop alakjában alkalmazzuk, és a II általános képletű vegyületet vizes oldatban az oszlopon átfolyatva N-dezacilezünk. A reakció időtartama általában 3 és 30 óra között lehet, és akkor kell befejezni, amikor az I általános képletű aminovegyület termelése maximális. A reakció hőmérséklete 20-45 C , előnyösen 30—37 C lehet. A szubsztrátum koncentrációja az N-dezacilező hatékonyságtól függ, és általában 0,1% és 5% között lehet. A találmányban kiindulási anyagként használt II általános képletű vegyületet ismert módszerekkel állíthatjuk elő, azokat a II általános képletű vegyületeket, amelyek képletében R —COOH csoportot jelent, egy III általános képletű vegyületből vagy ennek sójából — ebben a képletben X a már megadott jelentésű — a Trigonopsis variabilis vagy egyéb mikroorganizmusokból kapott D-aminos?v-oxidáz hatására aerób körülmények között állíthatjuk elő (1 272 769 számú brit szabadalmi leírás), vagy a III általános képletű vegyületet vagy annak sóját a Trigonopsis variabilis vagy Fusarium sp. aktivált sejtjeivel kezeljük (47-39 595 számú és 49—117 205 számú japán nyilvánosságra hozatali irat). Azokat a II általános képletű vegyületeket, amelyek képletében R -COGOOH csoportot jelent, a III általános képletű vegyületekből kataláz enzim és D-aminosav-oxidáz enzim hatására állítjuk elő. A II általános képletben X hidroxil vagy acetoxicsoportot vagy nukleofil csoportot jelent, ezt a csoportot ismert módszerekkel cefalosporin C-ből kiindulva alakíthatjuk ki. Azokat a III általános képletű vegyületeket, amelyek képletében X hidroxilcsoportot jelent, észteráz hatásával állítjuk elő (42-7553 számú japán szabadalmi leírás), és azokat a III általános képletű vegyületeket, amelyek képletében X nukleofil csoportot 3