169838. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a chinosporin-S és chinosporin-C új antibiotikumok előállítására 169839 Eljárás nagytisztaságú 7-szín-benziloximetil-norborn-2-én -5-on- üzemi előállítására
5 169838 6 Növekedést serkentő anyag [xg/ml Vizsgált mikrobaelleries szer, [xg/ml Inhibíciós index p-amino-benzoesav 0,06 chinosporin= C 7200 E < 1,6 Szulfaquinoxalin 250 Szulfametoxipiridazin 62 Szulfametazin 125 <27 4000 1000 2000 „pepton-faktor" (peptonos készítmény formájában) 1400,0 chinosporin= C 9 • 105 E 200 Szulfaquinoxalin 16 <1,43- 10-» 1,14 • 10~2 A fenti táblázatban leírt kísérleteknél a növekedési faktorokat adott koncentrációban vettük, a gátló anyagokat pedig sorozat-hígításban. A melléjük írt koncentrációk annak a hígításnak felelnek meg, amely már látható gátlást okozott. A vizsgálatokat E. coli-val végeztük. A táblázatból kitűnik, hogy a chinosporin-C a p-aminobenzoesavhoz képest 40-160-szor hatásosabb, mint a vizsgált szulfonamid-készítmények. A peptonfaktorhoz képest viszont tízszer kevésbé hatásos, mint a szulfaquinoxalin, ennek azonban terápiás szempontból nincs jelentősége. A táblázatból kitűnik, hogy a chinosporin-C hatásmechanizmusa hasonló, de nem azonos a szulfonamidokéval. A chinosporin-C kromatográfiás vizsgálata: vízzel telített n-butanollal futtatva, majd autobiográfiás vizsgálatot végezve azt találtuk, hogy pH 6,0-os pufferrel impregnált papíron az autobiogramon egyetlen gátló folt jelenik meg és annak Rf értéke 0,185. A chinosporin-S és chinosporin-C antibiotikumok előállításának módját az alábbi példákkal szemléltetjük: 1. példa 1. Fermentálás rázott kultúrában 500 ml-es Erlenmeyer lombikokban a következő öszszetételű táptalajt készítettük 100 ml mennyiségben: 3 g kazein 0,5 g kukoricalekvár 0,15 g CaCO% (precipitált) 1,5 g szacharóz (külön sterilizálva 50%-os oldatban csapvíz ad 100 ml A táptalajokat különböző törzsek ferde-agar tenyészetéről lemosott spórával beoltottuk és körkörös mozgású rázógépen 28 C° hőmérsékleten rázattuk. Az alábbi táblázatban megadott eredményt kaptuk: Antibiotikus aktivitás Chinosporin-S Hg/ml Chinosporin-C E/ml B. coagulans OKI 0099 B. coagulans OKI 0100 B. coagulans ATCC 7050 2. példa 800 200 200 48" 24n 1600 400 400 160 160 160 48h 640 320 320 Fermentálás 10 l-es üvegfermentorban 10 literes üvegfermentorokban 6 liter alábbi összetételű steril táptalajt készítettünk: 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65* ammóniumszulfát KCl Na2 HP0 4 • 12 H2 0 MgS04 • 7 H2 0 CaC03 (precipitált) kukoricalekvár (szárazanyag) szacharóz (külön sterilizálva) pH = 7,0 sterilizálás előtt 0,4% 0,1% 0,1% 0,1% 0,2% 0,5% 2,0% A fenti táptalajt beoltjuk az 1. példa szerint készült 48 órás tenyészettel és habzásgátló szükség szerinti adagolása mellett, állandó keverés közben 28 C°-on tenyésztjük percenként 2—3 liter levegő átfúvása mellett. A tenyészet a 48. órában eléri a maximális antibiotikum-szintet, amikoris a B. coagulans OKI 0099 törzs használata esetén chinosporin-S-re 6400 [Ag/ml-t, chinosporin-C-re pedig 1280 E/ml-t mértünk. 3. példa Az antibiotikumok kinyerése 30 liter, a 2. példa szerint nyert 48 órás fermentlevet 45 g oxálsavval megsavanyítjuk, mire pelyhes csapadék válik ki. A csapadékot centrifugálással elkülönítjük. Kb. 500 ml üledéket kapunk és 29,5 liter többé-kevésbé tiszta felülúszó lé marad. A csapadékból állítjuk elő a chinosporin-S-t, a felülúszóból pedig a chinosporin-C-t. A chinosporin-S előállítása: a fentiek szerint kapott csapadékot 2 X 1000, majd 2 X 500 ml metanollal extraháljuk szobahőmérsékleten. Az egyesített extraktumokat 40 C°-ot meg nem haladó hőmérsékleten bepároljuk az eredeti térfogat 5—6%-ára. Sűrű sárga kenőcsös anyag válik ki. A vizes fázist elöntjük, a kenőcsös maradékot pedig vizes NaHC03 szuszpenzióval addig rázogatjuk, míg a maradék részben feloldódik, részben pedig mint olaj úszik a vizes fázis felett. A két fázist választótölcsérben szétválasztjuk és a vizes fázist, szűrés után ecetsavval megsavanyítjuk. A kiváló sárga csapadékot nuccson összegyűjtjük és vákuumban szárítjuk. 30 liter fermentléből 35,4 g chinosporin—S-t nyerünk ki (az elméleti 30%-a). A chinosporin-C előállítása: A fermentlé megsavanyítása után nyert 29 liter felülúszó pH-ját 7,2—7,3-ra állítjuk be ammóniumhidroxiddal, mire csapadék válik ki és a felülúszó átlátszóvá vagy legalább áttetszővé válik. A csapadékot elvetjük és a felülúszóhoz literenként 2 g aktív szenet adunk, fél óráig kevergetjük, majd a szenet kiszűrjük, desztillált vízzel kimossuk, majd pH 3-ra állított 60%-os vizes metanollal (6 X 400 mlrel) eluáljuk. Az egyesített eluátumokat 30 C°-ot meg nem haladó hőmérsékleten bepároljuk kb. 10—15 ml-re, a kivált csapadékot kiszűrjük és a tiszta folyadékhoz 3 térfogatnyi acetont adunk. A folyadékból csapadék 3
