169795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa- vagy béta-típusí kristályos 7-(D-alfa-amino-fenil-acetamido) -3-metil-cef-3-ém -4-karbonsav-monohidrát előállítására
169795 9 10 adszorbenssel töltött oszlopot, amely a cefalexin nagyobb mennyiségét adszorbeálta, S/V = 1,0 sebességgel 17 liter 20%-os metanollal, majd 34 liter 50%-os metanollal eluáljuk. Összegyűjtjük a cefalexint tartalmazó frakciókat, az egyesített oldat pH-ját 2 n hidrogénklorid oldattal 2,0-re állítjuk be, majd csökkentett nyomáson 300 ml-re töményítjük, miközben az oldat belső hőmérsékletét 15 C° hőmérsékleten tartjuk. Ezután 30 C° hőmérsékleten, keverés közben, 2 n nátriumhidroxiddal, 30 perc alatt 4,5-re állítjuk be a sűrítmény pH-ját, amikor a cefalexin-dihidrát kiválik az oldatból. Centrifugálással elkülönítjük a szuszpenzióból a kristályokat, vízzel, majd 50%-os metanollal mossuk őket. Két részre osztjuk a hasáb alakú kristályokból álló terméket; az egyik részt 20 C° hőmérsékleten, 16 órán át csökkentett nyomású térben szárítjuk. így 24 g, hasáb alakú kristályokból álló terméket kapunk, amely a cefalexinnel azonos. A kristályos termék igen sűrű és csak gyengén nedvszívó. A kristályok a Karl Fischer módszer szerint mérve 4,75% (1 mól) vizet tartalmaznak, Röntgen-diffrakciós képük megegyezik az előzőekben megadott, a [3-típusú monohidrátnak megfelelő képpel. MD = +151° (konc: 0,5, vízben); •*max=263nm; ES = 235.. Op.: 194 C°. A kristályok a mágneses magrezonancia spektrum szerint szennyezőanyagokat nem tartalmaznak. A hasáb alakú kristályokból álló dihidrát másik felét foszforpentoxid felett, mélyhűtőben, —5 C° hőmérsékleten 24 órán át szárítjuk, amikor 24 g hasáb alakú kristályokból álló cefalexin-monohidrátot kapunk. A termék a Kari Fischer módszer szerint 4,7% (1 mól) vizet tartalmaz; Röntgen-diffrakciós képe az a-típusú kristályoknak megfelelő képpel azonos. A termék fajsúlya, higroszkópossága és a többi fizikai tulajdonsága azonos a csökkentett nyomáson szárított termék tulajdonságaival, az egyedüli különbség a Röntgen-diffrakciós képben mutatkozik. 3. példa Az 1. példában megadottak szerint eljárva Actobacter turbidans IFO 3225 baktériumot tenyésztünk, majd 1 kg sejtet 2 liter tiszta vízben szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 1 g lizozimot (Takeda gyártmány) adunk, literenként 10 mM EDTÁ-val egészítjük ki, majd 5 C° hőmérsékleten 6 órán át keverjük. Ezután 420 atmoszféra nyomáson féltárjuk a sejteket. A lizátumhoz 10 mg dezoxiribonukleázt (Takeda) és literenként 10 mM MgS04 • 7H2 0-t adunk, majd 5 C° hőmérsékleten 3 órán át keverjük. Ezután literenként 0,2 mól Ca(CH3 COO) 2 -et és K2 HP0 4 -et adunk az oldathoz, amikor kalciumgél keletkezik. A csapadék eltávolítására percenkénti 10 000 fordulatszámmal centrifugáljuk a szuszpenziót. A kapott 2,1 liter térfogatú felülúszóhoz a fehérjék kisózására 0,9-es telítettségig ammóniumszulfátot adunk. A sóval telített szuszpenziót 10 000 fordulat/perc-es fordulatszámú centrifugában centrifugáljuk, az üledéket kevés vízben oldjuk, az oldatot dializálózsákba öntjük, és folyó vízzel szemben dializáljuk. A dializátumot karboximetil-cellulóz (Selva, NSZK) 5 kromatografáló oszlopon (pH 6,0, 0,01 mólos káliumfoszfát pufferral kiegyensúlyozva) kromatografáljuk, az eluálást a fentihez hasonló pufferral + 0,02 mól Náddal végezzük. A hatóanyagot tartalmazó frakciókat töményítjük. A tömény oldatot Sephadex G—100 (Phar-10 macia, Sweden) gélszűrőgyantán kromatografáljuk, az eluálást 0,01 mólos, pH 6,8 trisz-hidrogénkloriddal végezzük. Az aktív eluátumokat liofilizálva 6 g nyers enzimet kapunk. A nyers termék enzimaktivitása 20-szor nagyobb, mint a mosott sejteké. 15 Az enzim jellemzői a következők: Fajlagos aktivitás: 63 000 E/mg. (1 E az az enzimmennyisóg, amely 1 fxmól D-fenilglicin-metilésztert képes hidrolizálni 1 perc alatt 27 C° hőmérsékleten, pH 6,0 értéken, 20 mmólos vizes szubsztrátoldatban). 20 Mólsúly: 270.000 (Andrews-módszerrel mérve). Izoelektromos pont: pH 7,9 (amfolin-elektroforézis). Az előállított nyers enzimkészítménnyel a következő reakciókat végezzük el: 700 ml vízben, miközben pH-ját 6,0-on tartjuk, 7,0 g 25 7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsavat és 14,0 g D-fenilglicin-metilésztert oldunk, majd 2,82 g, a fenti eljárással előállított nyers enzimkészítményt adunk az oldathoz. 3 órán át 30 C° hőmérsékleten hagyjuk állni a reakció-30 elegyet. A reakciót állandó 6,0-os pH-értéken végezzük. A kitermelés 92%-os, a termék a cefalexinnel azonos, súlya 9,3 g. A reakció lezajlása után 2,0-re állítjuk be az elegy pH-ját, és csökkentett nyomáson, 18 C° hőmérsékleten, 50 ml-re töményítjük. A sűrítményt kevés, 35 poralakú aktív szénnel színtelenítjük, majd szűrjük. Állandó, 30 C° hőmérsékleten, egy óra alatt, cseppenként adagolt 1 n nátriumhidroxiddal 3-ra állítjuk be az oldat pH-ját, amikor a cefalexin prizmás kristályok alakjában kiválik. Ahogy a szuszpenzió pH-ja eléri a 40 3,5-öt, szűrjük, a kristályos szűrési maradékot kevés vízzel mossuk. Mivel az összegyűjtött kristályok kevés D-fenilglicint adszorbeálnak, 2-es pH-jú vízben újra feloldjuk őket, majd 30 C° hőmérsékleten, 1 óra alatt 1 n nátriumhid-45 roxiddal 4,5-re állítjuk be az oldat pH-ját, amikor a cefalexin hasáb alakú kristályos termékként kiválik az oldatból. Az adagolás befejeződése után azonnal szűrjük a szuszpenziót, a szűrési maradékot kevés vízzel mossuk. Közvetlenül ezután Röntgen-diffrakciós vizs-50 gálatot végzünk. A termék Röntgen-diffrakciós képe a cefalexin-dihidrátéval azonos. A kristályos terméket 10 Hgmm-es csökkentett nyomású, szobahőmérsékletű térben 16 órán át szárítjuk, így 4,3 g, hasáb alakú kristályokból álló terméket ka-55 punk. A kristályok víztartalma Kari Fischer módszere szerint mérve 4,8%, a kristályok Röntgen-diffrakciós képe a ß-tipüsu monohidrát-kristályokénak felel meg. A termék fizikai jellemzői: 60 [a]D = +148° (konc: 0,5, víz) ^m ax=263nm, Elem = 230. Op.: 194 C°. A termék a mágneses magrezonancia spektrum ada-65 tai szerint szennyezőanyagot nem tartalmaz. 5
