169771. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérjében dús termék előállítására
3 169771 4 A táptalaj továbbá nyomnyi mennyiségben ,egyéb elemeket (például kalciumot, mangánt, cinket, kobaltot, molibdént és bórt) is tartalmazhat a megfelelő sók formájában. Egy előnyös táptalaj összetételét az 1. példában közöljük. A találmány szerinti eljárást szakaszos, félig folyamatos vagy teljesen folyamatos üzemben hajtjuk végre. Folyamatos üzemvitel esetén a termelést szakaszosan indíthatjuk be, vagy a 37 173/72 sz. nagy-britanniai szabadalmi bejelentésben ismertetett gyors beindítási módszert alkalmazhatjuk. A stacioner állapot elérésekor a folyamatos tenyésztést úgy biztosítjuk, hogy a mikroorganizmust folyamatosan elkülönítjük a növekedő tenyészettől, és ugyanakkor friss közeg folyamatos adagolásával a tenyészet térfogatát állandó értéken tartjuk. A folyamatos tenyésztés során a növekedő tenyészet felső folyadékfázisában — a tenyészetbe táplált közeg metanol-tartalmától függetlenül — a metanol koncentrációját a növekedést biztosító határértéken tartjuk. Ez a koncentráció előnyösen kis, célszerűen 0,01 térfogat%ot meg nem haladó érték. A mikroorganizmus tenyésztését megfelelő felépítésű fermentációs berendezésekben, például keverővel ellátott zárt fermentorban vagy permetezőberendezéssel felszerelt fermentációs toronyban végezhetjük. A fermentorok hűtését belső hűtőberendezéssel vagy külső recirkulációs hűtőkígyóval biztosítjuk. A tenyészetet levegővel, oxigénnel vagy oxigénnel dúsított levegővel levegőztethetjük. A tenyésztést általában 30—50 C°-on, előnyösen 38— 45 C°-on végezzük. A tenyészet pH-ját adott esetben lúg, például nátriumhidroxid, káliumhidroxid vagy ammóniumhidroxid és/vagy sav, például kénsav vagy foszforsav beadagolásával 6,0 és 8,0 közötti értéken, előnyösen 6,4 és 7,4 közötti értéken tartjuk. A mikroorganizmus-sejteket tetszés szerinti ismert módszerrel különíthetjük el a táptalajtól, így például flokkulálást, ülepitést és/vagy kicsapást, majd ezt követően centrifugálást és/vagy szűrést alkalmazhatunk. A kapott biomasszát például fagyasztással vagy porlasztással szárítjuk, és ebben a formában emberi vagy állati táplálkozásra alkalmas tápanyagként vagy tápanyag-kiegészítésként használjuk fel. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa Pseudomonas extorquens rózsaszín pigmentet nem tartalmazó mutánsának elkülönítése D2 táptalajjal töltött lombikokban rázatás közben Pseudomonas extroquenst (NCIB No. 9399) tenyésztáptalaj összetétele a következő: 3,00 g/l 3,00 g/l 6,00 g/l 0,20 g/l 16,70 mg/l 0,66 mg/l 0,18 mg/l CuS04 • 5 H2 0 0,16 mg/l MnS04 • 4 H2 0 0,15 mg/l CoCl3 • 6 H2 0 0,18 mg/l H3 B0 3 0,10 mg/l Na2 Mo0 4 • 2H2 0 0,30 mg/l víz ad 1 liter ünk. A D2 táptal Na2 HP0 4 KH2 P0 4 (NH4 ) 2 S0 4 MgS04 • 7 H2 0 FeCl3 • 6 H2 0 CaCl2 • 2 H2 0 ZnS04 • 7 H2 0 A növekedés exponenciális szakaszában 10 ml tenyészetet elkülönítünk, és a mintához 0,1 ml etil-metil-10 -szulfonátot adunk. A szuszpenziót 30 percig 30 C°-on inkubáljuk, majd 103 élő mikroorganizmus/ml koncentrációra hígítjuk. A hígítás egyben a mutagen szer inaktiválására is szolgál. Az így kapott oldat 0,1 ml-es részleteit ezután 50 db „Lab Lemco" pepton-agar lemezre 15 permetezzük. A beoltott lemezeket 10 napon át 30 C°on inkubáljuk, majd a lemezeket megvizsgáljuk. A lemezeken hatféle mutáns-telep fejlődik. Ezek a telepek kezdetben fehérek, állás közben azonban sárgára színeződnek. A telepképző mutánsokat rendre Pl-gyel, 20 P2-vel,... P6-tal jelöljük. 2. példa 25 Pseudomonas extorquens rózsaszín pigmentet tartalmazó mutánsainak folyamatos tenyésztése A Pl, P2 és P3 jelű mutánst a következőképpen tenyésztjük: 2 literes laboratóriumi méretű fermentorokba 0,5 térfogat °/0 metanolt tartalmazó D 2 táptalajt töltünk. A fermentor tartalmát a megfelelő mutánst tartalmazó 100 ml inokulummal beoltjuk, és szakaszosan beindítjuk a fermentációt. A folyamatos tenyésztést a stacioner állapot elérésekor kezdjük meg. A tenyésztés során a rendszert 30 C°-on levegőztetjük és keverjük, és a közeg pH-ját nátriumhidroxid beadagolásával 6,4-es értéken tartjuk. 30 35 40 45 50 55 60 65 A kísérletek eredményeit az 1. táblázatban közöljük. A táblázatban összehasonlítás céljából a rózsaszín pigmentet tartalmazó kiindulási mikroorganizmussal végzett kísérletek eredményeit is feltüntetjük. Az eredményekből megállapítható, hogy a 2. sz. mutáns kétszereződési sebessége és egységi mennyiségű metanolra vonatkoztatott biomassza-hozama nagyobb az alaptörzsénél. 1, táblázat Mikroorganizmus Kétszereződési idő, óra (szakaszos Hozam (biomassza száraz súlya, g/felhasznált metanol súlya, g) Ps. extorquens (alaptörzs) 3,75 0,40 Pl mutáns 6,75 0,43 P2 mutáns 3,40 0,50 P3 mutáns 4,50 0,37 Szabadalmi igénypont Eljárás tápanyagként használható fehérjében dús termék előállítására, ahol valamely a Pseudomonas nemzetségbe tartozó mikroorganizmus törzset aerob körül-2
